《Mitochondrion》：Mitofusin-2 (MFN2) is a critical regulator of metabolic homeostasis in neuronal cells: A metabolomic and proteomic study
编辑推荐：
•线粒体融合蛋白-2（Mfn2）敲低改变了细胞增殖和凋亡。•Mfn2在神经元线粒体代谢中发挥重要作用。•代谢组学分析揭示Mfn2可能参与谷氨酸-谷氨酰胺循环。•牛磺酸成为Mfn2调节的代谢过程中的关键代谢物。引言神经元在很大程度上依赖线粒体代谢来维持能量稳态。因此，无论因遗传
- •
线粒体融合蛋白-2（Mfn2）敲低改变了细胞增殖和凋亡。
- •
Mfn2在神经元线粒体代谢中发挥重要作用。
- •
代谢组学分析揭示Mfn2可能参与谷氨酸-谷氨酰胺循环。
- •
牛磺酸成为Mfn2调节的代谢过程中的关键代谢物。
引言
神经元在很大程度上依赖线粒体代谢来维持能量稳态。因此，无论因遗传还是非遗传原因，线粒体代谢通路的任何紊乱都会严重损害神经元健康和功能（Trigo等，2022）。线粒体的结构完整性对于维持线粒体形态和协调细胞增殖、对凋亡刺激的反应等多种细胞过程至关重要（Zhou等，2021）。线粒体的结构和功能受到质量控制系统（包括调控其融合和分裂）的严格调控。这两个相互对立的过程之间的平衡确保了线粒体健康（Chen等，2023）。
线粒体融合受包括线粒体融合蛋白-1（Mfn1）、线粒体融合蛋白-2（Mfn2）和视神经萎缩蛋白-1（OPA1）在内的蛋白质调控，而分裂过程则受动力学相关蛋白-1（Drp1）、线粒体分裂蛋白-1（Fis1）和线粒体分裂因子-1（Mff1）调控（Kulkarni等，2023；Hall等，2014）。Mfn1和Mfn2均为介导线粒体外膜融合的GTP酶，而OPA1则促进线粒体内膜的融合（Kulkarni等，2023）。线粒体融合与分裂过程之间的失衡与许多疾病相关，包括心血管疾病（CVD）、2型糖尿病（T2DM）、肥胖、癌症，以及神经退行性疾病如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和创伤性脑损伤（TBI）（Filadi等，2018；Yang等，2021；Itoh等，2013）。
Mfn2是一个多效基因，其定位于内质网（ER）-线粒体接触位点，即线粒体相关膜（MAMs）。由于这一特性，Mfn2参与调控包括增殖、自噬、凋亡、葡萄糖稳态、胰岛素信号通路和钙稳态在内的多种细胞过程（Chen等，2014；Ding等，2015；Sebastian等，2016；Shen等，2007；Sebastian等，2012；Inagaki等，2022）。此外，Mfn2还参与调控氧化磷酸化（OXPHOS）系统中蛋白质的功能，并在超级复合体的形成中发挥作用（Segales等，2013；Pich等，2005）。值得一提的是，Mfn2的存在是辅酶Q生物合成的先决条件（Mourier等，2015）。Mfn2基因突变与Charcot-Marie-Tooth型2型萎缩（CMT2A）的进展相关（El Fissi等，2018）。Mfn2水平的降低与肥胖、T2DM、心肌病和TBI的进展相关（Bach等，2005；Bach等，2003）。特别是，神经元中Mfn2的缺乏会改变线粒体转运并导致轴突变性（Baloh等，2007；Mou等，2021）。在小鼠海马中敲除Mfn2基因会加剧一系列病理事件，如线粒体碎片化、神经炎症、异常细胞周期进程以及最终的神经元死亡（Han等，2020）。值得注意的是，Mfn2的丧失与谷氨酸兴奋性毒性相关（Wang等，2015；Martorell-Riera等，2014）。因此，Mfn2在维持线粒体能量代谢所必需的质量控制过程中发挥重要作用。
基于上述背景，本研究探讨了Mfn2在神经元细胞能量稳态中的作用。我们证明，在SH-SY5Y神经元细胞中敲除Mfn2会影响其增殖、改变细胞周期分布、诱导氧化应激、加剧线粒体功能障碍，最终导致凋亡。这与线粒体生物发生基因表达显著降低有关。蛋白质组学和代谢组学分析鉴定出糖酵解、三羧酸（TCA）循环和OXPHOS是神经元细胞中Mfn2敲低条件下主要受扰动的能量代谢通路。此外，谷氨酸和谷氨酰胺水平的升高表明Mfn2在调控谷氨酸兴奋性毒性反应方面具有重要作用。牛磺酸是一种重要的神经调节剂和抗炎反应调节剂，在Mfn2敲低后SH-SY5Y细胞中的牛磺酸水平下调，而随后补充牛磺酸则恢复了线粒体膜电位（MMP）、氧化应激及相关生物能量缺陷。据我们所知，本研究首次表明Mfn2对神经元细胞中细胞过程的有效功能和线粒体生物能量的维持至关重要。此外，我们报告牛磺酸作为因线粒体功能障碍引起代谢缺乏相关疾病管理中的关键因素和治疗靶点。
各节摘要
材料
细胞培养基DMEM/F12（货号11330-032）、灭活胎牛血清（FBS）（货号10082-147）、青霉素-链霉素（货号15140-122）、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）（货号25200056）、Opti-MEM（货号11058021）、磷酸缓冲盐水（PBS）pH 7.4（10×）（货号70011-044），均购自Gibco?（Thermo Fisher Scientific）。Lipofectamine? RNAiMAX转染试剂（货号13778030）、Novex ECL化学发光底物试剂试剂盒（货号WP20005）、Tali?凋亡试剂盒
结果
Mfn2已知可维持线粒体相关膜（MAMs），从而调节多种细胞过程（Kulkarni等，2023；Filadi等，2018；Sebastian等，2012；Zhao等，2017）。神经元中Mfn2的丧失与神经退行性变的进展相关（Kulkarni等，2023；Filadi等，2018）。本研究推测了Mfn2在导致神经元丢失的代谢重编程中的作用。通过siRNA进行的Mfn2敲低通过以下方式得到确认
方法学考量
本研究利用未分化的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系来阐明Mfn2在线粒体代谢中的作用。这些神经母细胞瘤衍生SH-SY5Y细胞与成熟的有丝分裂后神经元存在显著差异。除这一局限性外，该细胞系具有儿茶酚胺能特性，并已被广泛用于研究帕金森病（PD）发病机制中涉及的分子和细胞机制（Xicoy等，2017；Kovalevich和
局限性与未来展望
本研究采用未分化的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系模型进行Mfn2瞬时敲低，该模型无法复现人类神经元的复杂性和成熟度。因此，本研究的发现应解释为机制性见解而非神经元病理的确定性证据。因此，未来研究应包含挽救实验、原代神经元或iPSC来源神经元的利用以及体内研究，以推导出机制性
CRediT作者贡献声明
Prakash G. Kulkarni：撰写-初稿、调查研究、形式分析、数据整理。Soumya S. Sahoo：调查研究。Vaibhavi M. Mohire：调查研究。Shilpy Sharma：撰写-审阅与编辑、指导、调查研究。Jeetender Chugh：撰写-审阅与编辑、项目管理、调查研究、数据整理。Tanushree Banerjee：撰写-审阅与编辑、指导、调查研究、概念设计。Amul J. Sakharkar：撰写-审阅与编辑、撰写-初稿，
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢
PGK感谢印度医学研究委员会、印度政府授予的高级研究奖学金（ICMR SRF文件编号2019-6565/CMB/BMS）。SSS感谢CSIR颁发的奖学金（09/936(0316)/2021-EMR-I）。作者感谢浦那印度科学研究所（IISER-Pune）的HF-NMR设施（由DST-FIST和浦那IISER共同资助）。
数据与材料可用性
有关数据可用性的咨询请联系通讯作者。
资助
本研究得到了印度大学拨款委员会、印度政府（UGC-GOI；F.4-5/151-FRP/2014/BSR）以及Anusandhan国家研究基金会-科学与工程研究委员会（ANRF-SERB），GOI（EMR/2017/000621；CRG/2020/004971；CRG/2022/004795）的资助，由AJS获得。TB感谢印度科学和技术部（DST）、印度政府颁发的DST-INSPIRE教授奖学金（IFA13-LSBM70）以及Dr. D. Y. Patil Vidyapeeth, Pune颁发的校内研究基金（DPU/559 (1)/2020）。SS由
Prakash G. Kulkarni | Soumya S. Sahoo | Vaibhavi M. Mohire | Shilpy Sharma | Jeetender Chugh | Tanushree Banerjee | Amul J. Sakharkar
