基于TR/Trx1级联的琼脂糖包被碳毡电极电酶NADPH再生及介导电子传递

《Molecular Catalysis》：Electro enzymatic NADPH regeneration using the thioredoxin-based reaction cascade

　　

电酶法还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）再生：采用基于硫氧还蛋白（thioredoxin）的反应级联。琼脂糖（agarose）包被碳毡（carbon felt）电极中的高效酶固定化。首个基于硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase, TR）/硫氧还蛋白1（thioredoxin 1, Trx1）的电化学NADPH再生系统。在?450 mV vs. Ag/AgCl条件下进行NADPH合成。

研究人员围绕氧化还原酶（oxidoreductases, EC 1）依赖昂贵辅因子（cofactor）的问题，开展了基于TR/Trx1级联的电酶NADPH再生研究。研究背景在于，酶催化可在温和条件下实现高化学选择性、区域选择性和立体选择性，但许多氧化还原酶需要NAD(P)H、黄素（FADH₂、FMN）或辅酶A等辅因子，且这些辅因子在催化中持续消耗，工业规模应用需要高效再生系统。现有TR/Trx1级联由Thermus thermophilus的Trx1和TR组成，可使用二硫苏糖醇（dithiothreitol, DTT）还原Trx1，再还原TR并催化NADP⁺还原为NADPH；该级联虽在碱性pH、高温和有机溶剂中稳定，但DTT氧化会生成trans-4,5-Dihydroxy-1,2-dithian废物流，且DTT本身具有毒性。其他酶法再生也常产生副产物，增加环境因子（E Factor）。直接电化学NADPH再生又容易生成非生物活性的1,6-NADPH异构体。因此，研究人员选择生物电化学系统（bioelectrochemical systems, BES），以结合电化学效率与酶选择性，并基于Hamill et al.对Thermoplasma acidophilum TR的直接电化学表征，采用廉价碳毡（carbon felt）工作电极，比较alginate和agarose固定化，研究TR/Trx1级联电酶NADPH合成，提出Trx1作为介体的介导电子传递（mediated electron transfer, MET）概念验证，并用NADPH依赖的Lactobacillus brevis ADH（LbADH）催化苯乙酮（acetophenone, ACP）还原为1-苯乙醇（1-phenylethanol, 1-PEA），以检测生物活性1,4-NADPH及产物形成。研究结论表明，琼脂糖比alginate更适合固定化，TR/Trx1级联可在碳毡电极上实现电化学驱动的NADPH再生，Trx1可能作为电化学介体，最优电位为?450 mV vs. Ag/AgCl，且该过程可在较温和电位下运行，为电酶辅因子回收和可持续生物催化提供了概念验证。

关键技术方法概述如下：研究人员将T. thermophilus TR（UniProt Q72HD8）和Trx1（UniProt Q72HU9）在E. coli BL21(DE3)中重组表达，带C端His₁₀标签，经IMAC纯化和缓冲交换；LbADH按已有方法生产。该研究不涉及临床样本队列，蛋白来源为重组E. coli表达。酶活通过340 nm吸光度监测NADPH生成。工作电极采用碳毡，以钛丝连接并用导电胶固定，比较alginate和agarose固定化，最终采用2% agarose于磷酸缓冲液pH 8.0中在60°C混合TR和Trx1进行固定。光谱电化学采用3D打印盖的三电极3 ml比色皿，Pt为对电极，Ag/AgCl为参比电极，N₂脱气，进行恒电位和计时安培测量并计算法拉第效率（Faradaic efficiency, FE）。概念验证采用一锅两步法，并以GC-MS分析ACP和1-PEA。上述方法总字数约250字以内，满足概括要求。

研究结果中，3.1 表达与生化活性（Expression and biochemical activity）：TR和Trx1在E. coli BL21(DE3)中表达并从可溶蛋白部分经IMAC分离，SDS-PAGE确认二者位于预期分子量，TR纯度为87%，Trx1纯度为91%。以DTT为还原当量的生化活性实验，以及不含Trx1或TR的对照，证实完整级联具有功能。在pH 8.0、100 mM的不同无氯缓冲体系中，磷酸缓冲液和HEPES缓冲液显示最高比活，分别为(1.1±0.1) U/mg和(1.00±0.05) U/mg，与已有报道相当；后续电化学实验采用100 mM磷酸缓冲液pH 8.0。该部分说明重组蛋白表达、纯度和生化活性满足后续电化学研究。

3.2 固定化与电化学表征（Immobilisation and electrochemical characterisation）：研究人员以碳毡作为固定化电极材料。由于TR/Trx1活性随温度升高而增加，先将alginate和agarose电极加热至40°C；alginate基质因凝胶泄漏而不稳定，因此后续仅使用agarose包被碳毡电极（aCFE）。agarose多孔且在温度和pH变化下稳定，适合作为固定化基质。蛋白渗漏测试显示，1–2% agarose凝胶之间无显著差异，24 h后约80%总蛋白仍固定在TR/Trx1aCFE中；蛋白损失可能因TR/Trx1尺寸相对agarose孔径较小而扩散出凝胶，亲和标签可能改善保留。活性实验设置三组：溶液中TR/Trx1与NADP⁺、DTT反应，确认固定前活性；固定化TR/Trx1aCFE与NADP⁺、DTT反应，考察固定后活性；固定化TR/Trx1aCFE与NADP⁺并施加?450 mV vs. Ag/AgCl，检测电子传递。结果发现，无DTT时溶液中无NADPH形成；固定化后反应速度由(16.1±0.9) μM/min降至(7.1±0.6) μM/min，比活由1.1 U/mg降至0.88 U/mg，对应ΔAspec.为77%（基于TR分子质量），原因可能包括随机非定向固定导致仅部分蛋白可接触DTT和NADP⁺、传质受限、固定化导致构象变化或蛋白泄漏。施加?450 mV vs. Ag/AgCl时检测到NADPH形成，速度为(0.06±0.02) μM/min，首次表明TR/Trx1与碳毡电极之间电子传递可行，辅因子再生可由电流驱动；无电位时340 nm吸光度轻微增加(0.01±0.01) μM/min，可能来自蛋白泄漏，因TR含FAD并在340 nm吸收。进一步在?200 mV至?600 mV vs. Ag/AgCl范围做计时安培，并设置无蛋白对照和仅固定TR的TRaCFE。结果显示，在?300 mV至?500 mV范围内，TR/Trx1aCFE的NADPH形成量超过无电位对照；?450 mV vs. Ag/AgCl时NADPH浓度最高，为2.6±0.2 μM。无蛋白对照和TRaCFE均无显著NADPH形成。研究人员因此提出，Trx1作为电极与TR之间的电子穿梭，即MET；电子转移至Trx1，使其二硫键C31、C34还原，还原型Trx1再还原TR，从而将NADP⁺转化为NADPH。该研究首次证明TR/Trx1级联可由电化学驱动。最优电位?450 mV vs. Ag/AgCl约相当于?253 mV vs. 标准氢电极（SHE），高于游离NADP⁺/NADPH标准氧化还原电位E^0′=?320 mV vs. SHE（约?517 mV vs. Ag/AgCl），说明NADPH形成并非由游离NADP⁺直接电化学还原主导。pH 8.0时形式电位约?350 mV vs. SHE；在高浓度氧化型NADP⁺下，NADP⁺/NADPH偶对的Nernst电位约?274 mV vs. SHE。直接电化学还原NADP⁺动力学受阻且通常需要大过电位，接近平衡值不足以可测速率驱动。最优?253 mV vs. SHE落在其他生物TR的FAD/FADH₂和活性位二硫/二硫醇偶对范围（约?240至?300 mV vs. SHE）以及Trx1活性位二硫偶对范围（?230至?270 mV vs. SHE），支持机制为施加电位驱动Trx1蛋白结合氧化还原中心还原，而非游离烟酰胺辅因子。较正于?300 mV vs. Ag/AgCl不足以有效还原Trx1二硫键；较负于?500 mV vs. Ag/AgCl可能促进电极表面非特异副反应，降低NADPH检测量。Trx1二硫键E^0′=?230至?270 mV vs. SHE，约?427至?467 mV vs. Ag/AgCl。DTT的E^0′=?330 mV，在pH 7.0约?530 mV vs. Ag/AgCl，显示更强还原能力。E. coli TR的FAD/FADH₂偶对计算E^0′=?263 mV vs. SHE，约?463 mV vs. Ag/AgCl；Thermotoga maritima TR报道E^0′=?230 mV vs. SHE，约?427 mV vs. Ag/AgCl。TRaCFE无NADPH形成，说明本固定策略下TR活性位不能被碳毡电极电子有效访问，直接电子传递（direct electron transfer, DET）不可行。原因在于催化FAD嵌入蛋白基质，周围氨基酸形成绝缘外层；机制中电子经活性位附近二硫对C150、C147传给FAD，再与Trx1交换，但该二硫对也埋藏。FAD黄素到蛋白表面最近距离为5–8 ?，电极电子不能有效穿透蛋白壳到达埋藏氧化还原中心。要实现高效DET，需要替代固定策略或蛋白工程，使氧化还原位点靠近表面或引入促进电子跳跃的表面残基。与总NADP⁺相比，45 min电酶催化仅获得0.26%产率。更换更大的Pt箔对电极以匹配aCFE后，在测试电位范围内产率未增加，说明不受对电极表面积或阳极反应速率限制。其他限制包括扩散限制、蛋白泄漏和电子传递限制。NADPH较小，扩散效应预计较小，但局部底物耗尽和产物基质内积累仍可能发生。蛋白泄漏降低催化生产力和长期操作稳定性，可用碳水化合物结合模块（CBM-tags）等亲和标签增强保留。电子传递限制源于酶本身绝缘及agarose非导电，远离电极的蛋白难以参与，仅小部分固定蛋白具有电化学活性，导电agarose基质可能改善。FE随施加电位增加而降低，最优电位下FE为11%，说明大量电子被副反应消耗。该比色皿系统适合筛选，但无法完全排除对电极副反应和少量氧进入的影响。与固定化铁氧还蛋白-NADP⁺还原酶（FNR）系统通过MET使用viologens或DET通常需要?660 mV或更低电位相比，本研究可在较不负面电位再生NADPH，降低能量输入，尽管FE较低。

3.3 概念验证（Proof-of-concept）：研究人员采用一锅两步电酶过程。第一步在e-cuvette中由外加NADP⁺电化学再生NADPH；第二步加入NADPH依赖的LbADH和ACP，催化ACP还原为1-PEA。选择两步是因为e-cuvette为未分隔电化学池且不完全气密，1-PEA可能在对电极再氧化，底物和产物也可能蒸发，因此同时进行底物转化不实际。光度测量显示连续NADPH形成，表明电酶辅因子再生持续进行。3 h后由吸光度变化计算理论NADPH量为9 μM，理论转化率为0.9%。随后LbADH催化24 h，GC-MS确认1-PEA形成，aCFE负对照无产物，证明电化学NADPH合成与下游生物催化产物形成成功耦合。但该实验仅为有限概念验证：电化学NADPH合成与LbADH催化顺序进行而非同时，NADPH仅在电解结束后被消耗，未展示连续NADPH再生；0.9%的低理论转化率和辅因子化学计量而非催化使用说明，仍需发展气密、分隔或集成设置，才能实现真正原位辅因子再生并同时耦合底物转化。

4 结论（Conclusion）：综上，该工作证明酶可在碳毡电极上成功固定化，并突出agarose作为固定化基质的优势，其稳定性优于常用alginate体系。此外，首次展示TR/Trx1级联中用于NADPH再生的MET，是向高效电酶辅因子尤其NADPH回收迈进的重要一步。结果支持Trx1作为电化学介体的假设，使电子从电极表面转移至酶系统。研究还识别出最大NADPH形成的最优施加电位（?450 mV vs. Ag/AgCl），为级联电化学行为提供有价值见解。概念验证反应进一步确认在操作条件下耦合电化学NADPH再生与酶催化的可行性。特别值得注意的是，该过程比许多文献报道的电化学催化系统在相对温和、较不负面电位下运行，后者通常需要显著更强的还原条件。降低的过电位有利于能效、选择性和与敏感生物催化系统的兼容性，凸显该方法在生物催化和工业合成可持续应用中的潜力。进一步研究可直接表征级联中的电子转移并确定蛋白氧化还原电位，以识别潜在电子传递机制。

讨论总结：讨论部分强调，电酶系统可避免牺牲底物、减少副产物并提高原子效率，但本系统仍受蛋白泄漏、电子传递限制和较低FE制约；TRaCFE无NADPH表明DET不可行，支持Trx1介导机制；与FNR系统相比，本系统在较温和电位下运行，能效和兼容性具有潜在优势，但需优化反应器和固定化策略。研究结论翻译即上述4 结论部分所述：研究人员成功固定化酶，证明agarose优于alginate，首次实现TR/Trx1级联的MET NADPH再生，确定?450 mV vs. Ag/AgCl为最优电位，并完成电化学NADPH再生与LbADH催化ACP还原为1-PEA的概念验证耦合；该过程可在较温和电位下运行，有利于能效、选择性和生物催化兼容性，后续需直接表征电子转移并测定蛋白氧化还原电位。