PER2磷酸化调控的适应性选择与非典型哺乳动物昼夜节律及睡眠表型

《Ecology and Evolution》：Selection on PER2 Phosphorylation Regulation Underlies Atypical Mammalian Circadian Rhythms

　　

昼夜节律（circadian rhythms）是通过协调生理与行为同可预测环境周期来提高生存和生殖适合度的基础生物学过程。然而，在一些物种中，昼夜节律减弱、不规则甚至不可检测，可能反映对极端环境或特化生态位的演化响应。尽管如此，这些非典型表型的遗传基础仍未完全阐明。此处，研究人员调查了71个代表性哺乳动物物种中20个PER2相关基因的分子演化。研究人员在表现出非典型昼夜节律表型的哺乳动物谱系中鉴定出4个受正选择（positive selection）的基因，其中3个（CDK5、CSNK1E和GSK3B）参与PER2磷酸化（phosphorylation）的翻译后调控（post-translational regulation），提示PER2磷酸化调控因子可能促成谱系特异性昼夜节律变异。值得注意的是，CSNK1E——调控PER2磷酸化的关键激酶——在鲸类（cetaceans）中显示出正选择和加速演化特征，鲸类表现出单半球慢波睡眠（unihemispheric slow-wave sleep, USWS）。体外（in vitro）实验显示，海豚CSNK1E增加了PER2稳定化FASP位点S662的磷酸化，并延长了PER2蛋白半衰期（half-life），这一分子特征与昼夜节律振荡器振幅（circadian oscillator amplitude）和睡眠调控密切相关。增加的PER2磷酸化可能促成了与USWS期间持续清醒相关的睡眠和运动活动改变，这得到研究人员的细胞和整体动物实验支持。一致地，过表达海豚CSNK1E的斑马鱼（zebrafish）表现出运动活动升高和睡眠时长缩短。总体而言，研究人员的发现提供证据表明，PER2磷酸化调控的演化变化与非典型昼夜节律表型相关，并为哺乳动物昼夜节律可塑性（circadian plasticity）的遗传机制提供了新见解。

论文解读：PER2磷酸化调控演化与非典型哺乳动物昼夜节律

研究背景方面，昼夜节律（circadian rhythms）是内源性、约24 h周期，协调睡眠-觉醒、代谢和激素分泌等过程，使生物预测环境周期性变化，从而降低捕食风险并促进繁殖成功。多数物种呈典型近24 h节律，但极地物种、冬眠者、夜行物种、异关节目和海洋哺乳动物等可表现减弱、不规则甚至不可检测的昼夜节律，可能反映对极端生境或特化生活方式的谱系特异响应。例如，北极驯鹿（Rangifer tarandus）在连续夏季白昼或冬季黑暗中全天活动；除海豹科外，海洋哺乳动物进化出单半球慢波睡眠（unihemispheric slow-wave sleep, USWS），该睡眠状态与持续运动和警觉相关，部分脱离经典昼夜节律调控。此类非典型表型的遗传基础仍 largely unknown。PER2（Period circadian protein homolog 2，周期昼夜节律蛋白同源物2）是负反馈环路核心组分，与CRY蛋白结合形成复合物进入核内，抑制CLOCK/BMAL1（核心时钟转录因子）介导的转录。PER2缺失或破坏突变可导致节律紊乱或无节律，人类PER2变异与家族性睡眠时相提前综合征相关。比较研究提示，驯鹿、儒艮和鲸类等谱系中PER2存在谱系特异氨基酸替换，可能影响PER2-CRY相互作用；鲸类BMAL2特异突变可增加PER2表达。PER2丰度和活性受转录及翻译后调控，其中磷酸化是控制后续修饰时序的关键起始过程；CSNK1D、CSNK1E、GSK3B和CDK5等激酶可动态磷酸化PER2，调节其稳定性、亚细胞定位和节律周期。然而，调控PER2的基因是否参与哺乳动物非典型昼夜节律演化仍不清楚。因此，研究人员聚焦PER2调控网络，在71个代表性哺乳动物中分析20个PER2调控基因。

研究人员开展分子演化分析并结合细胞与整体动物功能实验，发现参与PER2翻译后磷酸化的基因在非典型节律谱系中富集正选择（positive selection）信号。体外实验表明，海豚CSNK1E（casein kinase I isoform epsilon，酪蛋白激酶Iε）增强PER2稳定化FASP位点S662的磷酸化，延长PER2半衰期（half-life），并增强对CLOCK/BMAL1介导转录激活的抑制；过表达海豚CSNK1E的斑马鱼表现出运动活动升高和睡眠时长缩短。该研究提示，PER2磷酸化调控的演化变化与非典型昼夜节律表型相关，为哺乳动物昼夜节律可塑性的遗传机制提供了新见解。

关键技术与方法概述：研究人员基于文献筛选20个PER2调控基因，从NCBI获取71个代表性哺乳动物（36个典型节律、35个非典型节律，包括鲸类、海牛类、鳍足类、驯鹿、懒猴、熊等）编码序列（coding sequences, CDS）；系统发育拓扑来自TimeTree，基因注释参照KEGG、STRING、UniProt和Ensembl。采用PRANK/FasParser2、MEGA7/MUSCLE和Gblocks进行比对过滤；用PAML CODEML分支模型、两比值分支模型、分支-位点模型（branch-site model）及HyPhy BUSTED检测选择压力，估计d_N/d_S（ω）；用FasParser2和祖先序列重建（ancestral sequence reconstruction）检测趋同或谱系特异替换；用PolyPhen-2、SIFT、AlphaFold和HDOCK评估功能和结构。体外用实验室来源HEK293T细胞、双荧光素酶报告基因（dual-luciferase reporter assay）、放线菌酮（cycloheximide, CHX）降解和蛋白免疫印迹（western blot）；体内用野生型AB株斑马鱼显微注射过表达，DanioVision/EthoVision监测行为。

结果部分：
3.1 非典型昼夜节律谱系中加速演化和正选择的信号：通过CODEML分支模型，研究人员在21个非典型节律物种末端分支发现CDK5（cyclin-dependent kinase 5，细胞周期蛋白依赖性激酶5）、CSNK1E、GSK3B（glycogen synthase kinase 3 beta，糖原合成酶激酶3β）、NFIL3和TEF加速演化，仅2个典型物种有类似信号；4个基因在13个非典型祖先分支加速。分支-位点模型在16个非典型物种末端分支鉴定CDK5、CSNK1E、GSK3B和TEF正选择，典型仅2个；BUSTED独立验证，18个非典型对5个典型。CDK5、CSNK1E和TEF见于USWS与夜行谱系，GSK3B限于USWS；部分基因在祖先分支也有信号。说明非典型节律谱系中PER2磷酸化调控基因富集正选择。
3.2 非典型昼夜节律谱系中的谱系特异性氨基酸替换：用FasParser2筛选谱系特异替换。非典型谱系约典型两倍；35个非典型物种有60个替换、跨13个基因，36个典型29个、跨11个。鲸类15个替换、7个基因；懒猴46个、16个基因；驯鹿32个、9个基因。未发现所有非典型谱系共享的替换；祖先重建未检测趋同或平行替换。说明变化以谱系特异为主。
3.3 谱系特异性氨基酸替换的功能域分析：功能域映射显示55%非典型替换在功能域内或旁，典型仅14个；PolyPhen-2和SIFT预测20个非典型替换可能影响功能，典型4个。SIRT1、SIK3、NFIL3、PTBP1在五类非典型谱系共有34个替换；SIK3替换位于N端无序区，SIRT1替换富集于CLOCK相互作用区。三个PER2磷酸化相关基因在USWS物种有正选择和加速演化；CDK5未见特异位点，GSK3B四个鲸类特异替换在低复杂度区且预测不影响结构功能；CSNK1E五个鲸类特异替换位于C端尾部，该区参与磷酸化调控。分子对接提示海豚CSNK1E C端与PER2氢键相互作用减少趋势，但单个替换对三维结构影响有限。说明CSNK1E C端替换值得功能验证。
3.4 海豚CSNK1E对PER2磷酸化和睡眠相关表型影响的体外与体内验证：体外，HEK293T细胞共表达FLAG-PER2与小鼠或海豚CSNK1E，抗pS662检测显示海豚CSNK1E显著增加PER2 S662磷酸化（p=0.0041）；CHX降解实验显示海豚CSNK1E组PER2半衰期5.55±0.25 h，较小鼠组3.48±0.2 h延长约60%（p<0.01）；双荧光素酶报告基因显示海豚CSNK1E更强抑制CLOCK/BMAL1驱动的PER2和PER1启动子活性（p=0.0368；p=0.0082）。体内，斑马鱼幼虫过表达海豚CSNK1E、小鼠CSNK1E或EGFP阴性对照，在光暗循环下监测3天；各组维持节律，但海豚CSNK1E组总运动距离高于小鼠组（1111.0±112.9 cm vs. 840.7±56.08 cm；p=0.0354），光期差异明显并持续到第6、7天；总睡眠时间少于小鼠组和对照（2456±247.4 min vs. 3475±88.86 min，p=0.0006；vs. 3239±100.5 min，p=0.0293）；暗期睡眠减少，暗期睡眠回合长度缩短，光期睡眠回合数增加，睡眠潜伏期无差异。说明海豚CSNK1E改变运动活动和睡眠行为输出。

讨论部分总结：讨论指出昼夜节律保守，但部分谱系部分解耦，分子机制未明。先前多聚焦单物种和PER2，本研究扩展至20个PER2调控基因和71个哺乳动物。18/20基因在非典型谱系有谱系特异演化，7/18共享于三种非典型谱系；TEF、CDK5、CSNK1E、GSK3B有强正选择。TEF在USWS和夜行物种；CDK5、CSNK1E、GSK3B为PER2翻译后磷酸化调节因子，176个正选择位点中72%位于保守蛋白激酶域，提示磷酸化调控富集。CSNK1E直接磷酸化S662，C端调节激酶活性和节律；海豚CSNK1E C端五个鲸类特异替换可能影响与PER2相互作用及自抑制调节，解释S662磷酸化增加。PER2磷酸开关模型中S662磷酸化促进稳定；细胞实验支持海豚CSNK1E稳定PER2。但CSNK1E也磷酸化BMAL1、CRY和E4BP4/NFIL3，不能排除其他通路。PER2降解动力学影响振荡振幅和睡眠巩固；PER2表达增加与睡眠减少相关；CSNK1E突变与睡眠片段化、节律振幅降低及REM/NREM调控有关。USWS可能部分解耦睡眠-觉醒与经典节律，以维持运动和警觉。斑马鱼结果支持增强CSNK1E活性导致活动增加和睡眠减少。研究承认斑马鱼与哺乳动物昼夜调节差异、瞬转限制、对照日夜间差异不显著等，未来需稳定转基因和更长记录。总体支持谱系特异分子修饰促进鲸类特化睡眠表型。

结论翻译：在本研究中，研究人员调查了哺乳动物非典型昼夜节律表型的分子演化机制。研究人员在非典型谱系中鉴定出强正选择信号，尤其是在参与PER2磷酸化调控的基因中。在细胞水平，研究人员聚焦PER2启动磷酸化位点S662，证明海豚CSNK1E增加该稳定化FASP位点的磷酸化，延长PER2半衰期，并增强对CLOCK/BMAL1介导转录激活的抑制。这些分子变化可能促成与非典型昼夜节律表型相关的昼夜反馈调节改变和睡眠相关行为适应。过表达海豚CSNK1E的斑马鱼表现出运动活动增加和睡眠时长缩短，进一步支持这一观点。总之，这些结果表明，PER2磷酸化调控因子上的正选择，连同CSNK1E的功能验证，将谱系特异分子演化与改变的PER2磷酸化、时钟转录输出和睡眠相关性状联系起来，从而可能促成特化生态背景下的非典型昼夜节律表型。总体而言，研究人员的发现增进了对塑造昼夜节律多样性的演化力量的理解，并为遗传变化如何促进哺乳动物昼夜节律可塑性提供了机制见解。然而，本方法存在若干局限，包括个体表达构建体共转染效率变异，Renilla标准化不能完全校正。使用内源基因表达直接定量和互补方法的进一步研究将阐明海豚CSNK1E的调控效应。