桉树微型母株枯梢病（Dieback）的病原菌种类鉴定、内生定殖特征及繁殖传播风险评估：基于Chrysoporthe属真菌的系统发育、致病性测定与无性繁殖体系追踪研究

《Forest Pathology》：Dieback of Eucalypt Mini-Stumps Caused by Chrysoporthe Species.: Pathogen Detection in Symptomatic and Asymptomatic Host and Pathogen Transmission in Mini-Clonal Hedge

　　

真菌Chrysoporthe cubensis已被报道在巴西的桉树微型无性系采穗圃体系中造成严重损失，该病害的特征为微型母株出现萎蔫、木质部病斑（xylem lesion）和枯梢（dieback）。本研究旨在调查Chrysoporthe属物种在微型无性系采穗圃中无症状微型母株、微型插穗（mini-cuttings）和已生根微型插穗（rooted mini-cuttings）内占据内生菌生态位（endophytic niche）的发生情况；通过扩展真菌分离物集合的系统发育分析（phylogenetic analyses）确认病原菌身份；评估病原菌是否从有症状微型母株传播至微型插穗和已生根微型插穗；并分析从微型母株中回收的Chrysoporthe spp.的致病性（pathogenicity）。研究人员在88%的分析有症状样本中回收并鉴定出Chrysoporthe cubensis，并以较低频率（12%）在两个Eucalyptus grandis × Eucalyptus urophylla杂交无性系的无症状样本中将其作为内生菌检出。此外，仅在1份有症状样本中鉴定出Chrysoporthe doradensis。在无症状微型插穗和已生根微型插穗中未检测到Chrysoporthe。致病性测定证实，从无症状桉树微型母株中回收的所有C. cubensis分离物在与参考分离物相同的时间范围内诱导了已生根微型插穗茎干上的坏死病斑（necrotic lesions）。C. doradensis分离物的致病性也在已生根微型插穗上得到确认。来自枯梢病受害母株和来自无症状母株的微型插穗，其生根比例无显著差异。此外，在由有症状微型母株产生的已生根微型插穗中未检测到Chrysoporthe，表明该病原菌不太可能通过营养繁殖（vegetative propagation）进行传播。这是全球首次报道C. cubensis在桉树微型母株中占据内生菌生态位，也是首次报道C. doradensis作为与巴西桉树微型母株枯梢病相关的额外物种。

论文解读

一、研究背景与科学问题

桉树是巴西最重要的林业作物，种植面积约800万公顷，其中38%服务于纸浆和造纸工业。巴西拥有全球最高的桉树生产力水平之一。无性繁殖，尤其是微型扦插（mini-cutting）技术，在桉树人工林的成功中发挥了关键作用。该技术涉及建立由供体植株（称为微型母株，mini-stumps）组成的无性系微型采穗圃，从中定期（通常每周）采收微型插穗，插穗随后在遮荫温室中于独立塑料管中生根，经驯化后运往最终种植地。

近期，Chrysoporthe cubensis——一种在田间早已闻名的桉树溃疡病（eucalypt canker）病原菌——首次被报道与桉树微型母株相关，并在巴西的微型无性系采穗圃中造成重大损失。Chrysoporthe枯梢病的初始症状包括萎蔫和木质部病斑，随后发展为冠部枯梢，最终导致微型母株死亡。受感染微型母株表面很少观察到子实体（fruiting bodies），仅在实验室湿室培养茎段后才被检出。此外，在微型采穗圃附近的桉树人工林中并未发生桉树溃疡病，否则该处可能被视为病原菌接种体的潜在来源。因此，该病害的流行病学仍知之甚少，因为尽管病原菌的繁殖阶段很少被观察到，有症状的微型母株仍会随时间推移在整个微型采穗圃中出现。基于这些情况，Martins等人提出C. cubensis可能以内生菌形式存在于桉树微型母株中。尽管尚无研究证明Chrysoporthe属物种在巴西商业植物中作为内生真菌存在，但有报道表明Cryphonectriaceae科真菌可以占据内生菌生态位。Mausse-Sitoe等人报道C. austroafricana和Celoporthe woodiana与莫桑比克原生桃金娘目（Myrtales）植物的无症状感染相关。Granados等人确认了Aurapex penicillata、C. cubensis和Chrysoporthe inopina是哥伦比亚野牡丹科（Melastomataceae）植物的内生菌。尽管这两项研究增进了对Chrysoporthe属物种生物学的理解，但桉树微型母株中无症状感染的发生情况仍不清楚。基于这一知识空白，研究人员检验了以下假说：C. cubensis——微型母株枯梢病的病原菌——可能占据桉树微型母株的内生菌生态位。

另一个对Cryphonectriaceae成员而言仍鲜有探索的方面是病原菌从受感染但外观无症状的植物（特别是幼苗）传播的可能性。更好地理解这一方面具有重要的实践意义，因为它可能为制定有效的病害管理策略提供基础，而目前该病害的管理策略十分有限。

基于对桉树微型母株Chrysoporthe枯梢病认识的局限性，本研究旨在：调查Chrysoporthe属物种在微型无性系采穗圃中无症状微型母株、微型插穗和已生根微型插穗内占据内生菌生态位的发生情况；通过扩展Chrysoporthe分离物集合的系统发育分析确认病原菌身份；评估病原菌是否从有症状微型母株传播至微型插穗和已生根微型插穗；并分析从微型母株中回收的Chrysoporthe spp.的致病性。

二、研究内容与主要结论

研究人员在巴西米纳斯吉拉斯州Belo Oriente市的微型无性系采穗圃中采集了桉树微型母株、微型插穗和已生根微型插穗样本，涉及两个Eucalyptus grandis × Eucalyptus urophylla杂交无性系（编号200000633和200000837）。研究发现：C. cubensis在88%的有症状样本中被回收和鉴定，并以较低频率（12%）在两个杂交无性系的无症状样本中作为内生菌检出；C. doradensis仅在1份有症状样本中被鉴定；无症状微型插穗和已生根微型插穗中未检测到Chrysoporthe。致病性测定证实，从无症状微型母株回收的所有C. cubensis分离物在与参考分离物相同的时间范围内诱导了已生根微型插穗茎干上的坏死病斑，C. doradensis分离物的致病性也得到确认。来自枯梢病受害母株和来自无症状母株的微型插穗生根比例无显著差异（分别为0.78和0.73），且在有症状微型母株产生的已生根微型插穗中未检测到Chrysoporthe，表明该病原菌不太可能通过营养繁殖传播。这是全球首次报道C. cubensis在桉树微型母株中占据内生菌生态位，也是首次报道C. doradensis作为与巴西桉树微型母株枯梢病相关的额外物种，具有重要的流行病学意义——无症状植株可能在维护修剪和微型插穗采收过程中促进病原菌在母株间及向插穗的传播。

三、关键技术与方法

研究人员采用了以下主要技术方法：田间采样（2023年3月和11月于巴西Belo Oriente的微型采穗圃采集样本）；真菌分离培养（使用马铃薯葡萄糖琼脂PDA、添加孟加拉红的PDA和水琼脂WA三种培养基，所有培养基添加氯霉素抗生素）；分子鉴定（提取基因组DNA后，PCR扩增β-微管蛋白基因的两个部分区域BT1和BT2，采用Sanger测序，结合最大似然法（ML）和贝叶斯推断（BI）进行多基因座系统发育分析）；致病性测定（对有症状和无症状来源的分离物进行茎干接种试验，测量木质部病斑长度）；以及微型插穗生根试验和病原菌检测（从有症状和无症状母株采集微型插穗进行生根，对新生根插穗进行组织分离培养和湿室培养检测）。

四、研究结果

4.1 真菌分离

从2年生和3年生有症状微型母株中分别回收了70个和109个Chrysoporthe分离物。2年生无症状微型母株未回收任何Chrysoporthe分离物；3年生微型母株中，从无性系200000633和200000837分别获得8个和2个分离物。在2年生微型母株中，两个无性系90%的有症状样本均回收了Chrysoporthe，但无症状样本均未检出。在3年生微型母株中，Chrysoporthe从无性系200000633的90%和200000837的100%有症状样本中回收；无症状样本的检出频率分别为20%（200000837）和30%（200000633）。在有症状样本中，病原菌主要从基部、中部和上部茎段检出，也见于基部+中部以及中部+上部组合；仅在10%的样本中Chrysoporthe仅从茎上部回收。3年生无症状微型母株中，Chrysoporthe从上部、基部+中部、基部+上部（200000837）以及上部+中部（200000633）等部位组合中回收。无症状微型插穗（n=25）和3月龄已生根微型插穗（n=20）均未检出Chrysoporthe。

4.2 Chrysoporthe物种的分子鉴定

序列数据库包含80个分类单元，包括代表Chrysoporthe属11个物种的36条序列、本研究产生的42条序列以及2条用于构建系统发育树根部的Amphilogia gyrosa序列。连接两个β-微管蛋白基因区域后的最终比对由745个核苷酸组成，其中576个为保守位点，90个为可变位点。基于BI和ML方法生成的连接系统发育树显示，本研究获得的41个分离物与C. cubensis（包括该物种的外模式标本分离物）聚类；另有1个分离物与C. doradensis（包括外模式标本分离物）形成单系群。

4.3 致病性测定

从无症状微型母株内部组织回收的所有5个C. cubensis分离物均在接种的桉树植株上诱导了坏死病斑。接种植株（含阳性对照）的平均病斑长度在接种后15天（dai）为10.7至14.8 mm，在45 dai为21.5至63.7 mm。在15 dai时，除分离物COAD 3920外，所有分离物诱导的病斑均大于阴性对照且与阳性对照统计学相似；在45 dai时，所有分离物的平均病斑长度均与阳性对照统计学相似。实验结束时，从接种植株的坏死病斑中重新分离出C. cubensis。在C. doradensis致病性测定中，所有接种植株均产生木质部病斑：接种C. cubensis（阳性对照）的平均病斑长度为16.1 mm，接种C. doradensis的为23.9 mm，两者间无显著差异，但均显著大于阴性对照。真菌在实验结束时从接种植株的木质部病斑中成功再分离。

4.4 从枯梢病受害母株采集的微型插穗的生根及新生根微型插穗中Chrysoporthe的检测

来自有症状和无症状微型母株的微型插穗生根比例分别为0.78和0.73。对新生根微型插穗内部组织的解剖未发现症状或病原菌迹象。通过茎组织片段平板培养，在新生根的微型插穗中未检测到Chrysoporthe；湿室培养的样本中也未观察到病原菌子实体。

五、讨论与结论

本研究首次揭示了C. cubensis在无症状桉树微型母株中占据内生菌生态位的能力。Cryphonectriaceae科真菌此前已在桃金娘目植物中被报道为内生菌。C. cubensis与微型采穗圃中无症状母株的关联可能具有重要的流行病学意义，因为无症状植株可能在维护修剪和微型插穗采收过程中促进病原菌的传播。然而，研究人员未能在采样点的无症状微型插穗和已生根微型插穗中回收Chrysoporthe，且从有症状母株产生的已生根微型插穗的无症状组织中回收病原菌的尝试也未成功，表明该病原菌不太可能以内生方式定殖已生根微型插穗。但需注意，未检出并不必然意味着病原菌不存在，因为其在寄主组织内的分布可能不均匀，且依赖培养的检测方法可能因组织片段不含目标生物而产生假阴性。

从无症状母株回收的分离物的致病性测定表明，它们能在15 dai内诱导木质部病斑，不支持这些分离物症状发育延迟的假说。研究还发现，从3年生微型母株中获得的Chrysoporthe分离物数量更高，且无症状样本中的病原菌检出仅发生在该龄期母株中，这可能与寄主植物长期暴露于接种体以及随时间推移反复修剪有关。病原菌在茎干不同部位的分布与症状表达相关，有症状母株的病原菌沿茎分布更广泛。在某些无症状和有症状样本中，病原菌仅从茎上部回收，提示修枝剪在采收微型插穗过程中可能在病害传播中发挥作用。

分子鉴定为巴西桉树微型母株Chrysoporthe枯梢病的病原学提供了新认识。C. cubensis从大多数有症状样本中回收，证实了其作为该病害病原菌的地位；C. doradensis则首次被报道在巴西引起桉树微型母株枯梢病。尽管C. doradensis和C. cubensis引起的木质部病斑长度无显著差异，但此前哥伦比亚的研究表明C. doradensis的某些分离物比其他Chrysoporthe物种更具攻击性，因此需要进一步研究C. doradensis在桉树微型母株上的攻击性，以更好地理解Chrysoporthe枯梢病的流行病学和管理策略。