《The FASEB Journal》：The Maternal Blood Transcriptome Reflects Molecular Signatures Associated With Large Offspring Syndrome and Other Adverse Pregnancy Outcomes in Cattle
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大型后代综合征（Large offspring syndrome, LOS）是牛的一种以胎儿过度生长为特征的现象，其与体外生产（in vitro produced）胚胎来源的犊牛高度相关。研究人员旨在测试是否能够利用妊娠早期母体血液转录组的变化来预测LOS以及
大型后代综合征（Large offspring syndrome, LOS）是牛的一种以胎儿过度生长为特征的现象，其与体外生产（in vitro produced）胚胎来源的犊牛高度相关。研究人员旨在测试是否能够利用妊娠早期母体血液转录组的变化来预测LOS以及另外两种不良妊娠结局——死产与流产的发生。在胚胎移植体外生产胚胎后，于妊娠40–50天采集荷斯坦牛及杂交青年母牛的血液样本。共选取203份样本进行RNA测序（RNA-sequencing），用于比较产下正常出生体重活犊的受体（对照组；n=96）与产下LOS犊牛（n=15）、死产犊牛（n=43）及妊娠210天前流产（n=49）的受体之间的差异。LOS的判定基于出生体重大于平均值2个标准差。与对照组相比，LOS、死产和流产组的差异表达基因（differentially-expressed genes, DEG）数量分别为32、176和100（p<0.01）。在过滤差异表达后，利用随机森林（Random Forest）在随机选择的平衡训练数据集中识别生物标志物，随后通过6种机器学习模型在留出数据集中对标志物进行检验。LOS、死产和流产的最佳生物标志物分别包含26、24和28个基因。预测准确率范围分别为：LOS为0.91至0.965，死产为0.73至0.98，流产为0.62至0.96。尽管样本量相对较小，但该模型在LOS分类上表现出高灵敏度，支持妊娠早期母体血液转录组能够反映与胎儿过度生长相关的分子改变，并可预测该疾病。
大型后代综合征（large offspring syndrome, LOS）是牛体外胚胎生产后出现的胎儿过度生长现象，与人类Beckwith-Wiedemann综合征（BWS）具有相似特征，可导致难产、剖宫产、死产和围产期死亡率升高，但目前缺乏早期诊断工具。已有研究发现妊娠期母体血液细胞转录组与胎儿发育状态相关，例如胎儿体型可影响母体血液分子谱，然而妊娠早期母体转录组是否可用于预测LOS、死产和流产仍不明确。本研究旨在鉴定妊娠40–50天母体血液转录组中与这些不良结局相关的分子改变，并开发预测性生物标志物。
研究人员在美国得克萨斯州Lubbock一个私营农场收集了1051份来自妊娠40–50天荷斯坦及杂交（荷斯坦×娟姗）青年母牛的血液样本，这些母牛均移植了由Genus PLC公司生产、使用常规或X-sorted精液制作的商业玻璃化荷斯坦胚胎。最终203份样本用于RNA测序（RNA-sequencing, RNA-seq），并根据妊娠结局分为对照组（正常出生体重活犊，n=96）、LOS组（n=15）、死产组（n=43）和210天前流产组（n=49）。LOS定义为出生体重大于其品种群体均值的2个标准差。通过与对照组比较，研究人员在LOS、死产和流产组中分别鉴定出32、176和100个差异表达基因（differentially expressed genes, DEG）（p<0.01）。进一步在随机选择的平衡训练集中用随机森林筛选特征，并借助多种机器学习模型验证，最终确定的生物标志物基因数分别为LOS 26个、死产24个、流产28个；留出测试集上的预测准确率分别为LOS 0.91–0.965、死产0.73–0.98、流产0.62–0.96。LOS预测模型灵敏度达到100%，说明早期母体血液转录组能够反映与胎儿过度生长相关的分子改变并具有预测潜力。
主要技术方法包括：全血RNA提取、链特异性文库构建及Illumina NovaSeq双端测序；利用STAR将读段比对至牛参考基因组（Bos taurus ARS-UCD2.0），以featureCounts获得基因表达矩阵；采用DESeq2进行差异表达分析（p<0.01，FDR<0.05）；应用方差分解评估协变量影响并用sva包校正妊娠日龄效应；通过Boruta随机森林进行特征选择，采用支持向量机、随机森林、惩罚回归（glmnet）、XGBoost、k近邻和朴素贝叶斯六种算法训练模型并评估泛化性能。样本选择上仅纳入已知为雌性胎儿的受体并限制了妊娠日龄范围，以控制潜在混杂因素。
**3.1 大型后代犊牛、死产和流产的发生率**：荷斯坦犊牛平均体重为41±6 kg（n=417），杂交犊牛为39±5 kg（n=101）。以出生体重>2个标准差定义LOS，其发生率为3.1%（16/518，仅雌性活犊）。死产发生率为10.7%（62/580），210天前流产发生率为11.9%（96/809）。这些数据为后续分组和模型评价提供了基础。
**3.2 转录组方差来源**：方差分解显示，在总解释变异（约11.5%）中，血样采集时妊娠日龄的四分位分组贡献最大（37.9%），其次为组别等因素。因此，后续差异表达和生物标志物分析均对妊娠日龄进行了统计控制。
**3.3 与LOS相关的差异表达基因**：对照组与LOS组比较，共32个DEG（17个上调、15个下调）。在FDR<0.05的严格阈值下，仅1个未注释基因上调。上调DEG富集于细胞外基质组织、组装和基底膜组织等基因本体（GO）通路，提示母体血细胞转录组存在与组织重塑相关的改变，而下调DEG无显著富集通路。
**3.4 与死产相关的差异表达基因**：对照组与死产组比较，共176个DEG，其中81个上调、95个下调。在FDR<0.05水平，存在1个上调基因CD109和5个下调基因（ACTC1、LMOD2、MYBPC1、MYH7和MYOZ2）。上调基因富集于细胞周期调控、染色体组织与分离通路；下调基因富集于肌肉结构发育通路。
**3.5 与流产相关的差异表达基因**：对照组与流产组比较，共100个DEG，其中60个上调、40个下调。严格阈值下只有2个基因（GALNT14和1个未注释基因）显著上调。上调DEG未富集出显著通路，而下调DEG富集于细胞因子介导的信号、干扰素信号及对病毒感染的防御反应等免疫相关通路。
**3.6 各组间DEG的一致性**：韦恩图分析显示三组间重叠基因极少。流产与死产共享4个上调基因（CAPN13、EZH2、FAM180A、IQGAP3）和4个下调基因（AOX4、ATP8B4、PRKN、RSAD2）；LOS与死产共享1个上调基因（OR7D2）；LOS与流产之间无共享DEG。这一结果提示不同不良妊娠结局具有部分独立的分子特征。
**3.7 LOS的生物标志物发现**：用10例LOS和10例对照作为训练集筛选出26个基因标志物，在留出集（5例LOS、5例对照）上预测准确率为90%，灵敏度100%、特异度80%。将模型应用于其余91个样本时，86个正常样本中有8个被误判为LOS，而5个LOS样本全部正确，总体准确率91%、灵敏度100%。在限制于至少55%预测一致性样本（n=86）时，准确率提高至96.5%，特异度96.3%，灵敏度仍为100%。26个标志物基因中18个与LOS正相关、8个负相关；正相关基因富集于细胞表面、系统发育等通路，负相关基因涉及免疫相关通路。
**3.8 死产和流产的生物标志物**：类似流程分别鉴定出24个死产标志物和28个流产标志物。在留出测试集（每组10个样本）中预测准确率、灵敏度和特异度均介于80%–90%，死产组表现更好。当模型应用到全部剩余样本时，死产预测准确率降至72%–73%，流产降至62%–63%；将分析限制在高一致性样本（≥55%一致）后两组分类一致性提高，提示死产和流产组内存在表型异质性，影响稳定的共同信号提取。
讨论部分认为，母体血细胞转录组在妊娠40–50天已可捕获与LOS、死产和流产相关的分子变化，且这一孕周早于以往报道的相关研究，拓展了母体转录组用于早期预测的概念。LOS标志物中包含IL26、IL33等促炎细胞因子基因和CASP4等天然免疫相关基因，可能反映母体对异常胎儿/胎盘发育的免疫应答，但更可能是一种伴随现象而非致病原因。不同结局对应不同生物学通路，支持各不良结局具有特异性的母体反应。本研究中LOS组样本量较小（n=15）是限制阳性预测值偏低的主要原因，未来需要扩大样本量并跨牧场验证；而死产和流产模型预测性能有限则与这些结局的病因多样和发生时间未知有关。
综上所述，本研究证实妊娠早期母体血液转录组含有与牛不良妊娠结局（LOS、死产和流产）相关的信息性分子特征；不同结局之间差异表达基因重叠度低，表明每种状况具有部分独特的分子特征。这些发现支持将母体血液作为一种非侵入性生物标志物来源，并有望进一步发展为预测妊娠结局和犊牛表型的生物检测方法。
