《Journal of Biomedical Materials Research Part A》：Dual Modification of Collagen Hydrogels Using UVA-Riboflavin Crosslinking and Silk Fibroin Incorporation to Enhance Mechanical Properties, Stability, and Printability
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Ⅰ型胶原因其生物相容性、生物降解性及支持细胞黏附和增殖的能力而成为优选生物材料。然而，胶原水凝胶在组织工程（tissue engineering，TE）中的应用因其较差的力学性能和低稳定性而受到限制。本研究提出了一种新颖的双重修饰策略，将UVA介导的核黄素/过
Ⅰ型胶原因其生物相容性、生物降解性及支持细胞黏附和增殖的能力而成为优选生物材料。然而，胶原水凝胶在组织工程（tissue engineering，TE）中的应用因其较差的力学性能和低稳定性而受到限制。本研究提出了一种新颖的双重修饰策略，将UVA介导的核黄素/过硫酸钠（riboflavin/sodium persulfate，RF/SPS）光交联与未超声丝素蛋白（silk fibroin，SF）的掺入相结合，以增强胶原性能，该策略此前未见报道。研究人员制备了四种胶原水凝胶：未交联胶原（uncrosslinked collagen，UXL-C）、UVA介导RF/SPS光交联胶原（XL-C），以及掺入SF的UVA-RF/SPS光交联胶原，采用两种不同胶原：SF比例（XL-CS 1:1 w/w和XL-CS 1:2 w/w）。力学测试和稳定性结果表明，UVA-RF/SPS光交联与SF掺入相结合显著（p < 0.05）提高了胶原水凝胶的压缩模量并增加了质量保留率，提示添加未超声SF可改善光化学交联胶原水凝胶的力学性能和稳定性。所有水凝胶组分均表现出剪切变稀行为，证明了其通过悬浮水凝胶自由形式可逆嵌入（Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels，FRESH）方法进行挤出式3D打印的适用性。与仅含胶原油墨打印的构建体相比，3D打印的掺入SF的胶原构建体显示出更高的形状保真度。体外细胞培养研究表明，所有水凝胶配方均在7天培养期内支持细胞活力和代谢活性。综上所述，这些发现证明将UVA介导的RF/SPS光交联与未超声SF掺入相结合，是改善用于生物医学和TE应用的胶原水凝胶力学性能、稳定性和可打印性的可行策略。
I型胶原是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的主要结构蛋白，提供调控细胞稳态和功能的关键生物物理和生化信号。由于固有的生物相容性、低免疫原性和丰富的细胞黏附位点，I型胶原是组织工程（tissue engineering，TE）中最广泛使用的生物材料之一。然而，重组胶原水凝胶缺乏天然组织的层级结构和交联密度，导致力学强度弱、稳定性差。传统增强方法中，化学交联剂如戊二醛和EDC-NHS能形成共价网络，但存在细胞毒性；酶促交联如辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）和转谷氨酰胺酶虽生物相容性较好，但反应时间长且难以控制。光化学交联使用核黄素（riboflavin，RF）作为光敏剂，在UVA（320–400 nm）照射下产生自由基，促进胶原分子间共价交联，但单独使用RF凝胶化动力学慢；加入过硫酸钠（sodium persulfate，SPS）作为共引发剂可加速反应。另一方面，掺入天然机械增强聚合物如丝素蛋白（silk fibroin，SF）可提高基质刚度。SF通常需经超声处理诱导β-折叠形成以获得机械增强，但超声参数波动导致批次间差异大。因此，研究人员提出了将UVA-RF/SPS光交联与未超声SF掺入相结合的双重修饰策略，旨在绕过超声问题并协同增强胶原水凝胶性能。该策略此前未见报道。
研究人员制备了四种水凝胶：未交联胶原（UXL-C）、UVA-RF/SPS光交联胶原（XL-C）、以及掺入SF的两种比例（1:1和1:2 w/w）的光交联复合水凝胶（XL-CS 1:1和XL-CS 1:2）。通过单轴压缩、7天质量保留、扫描电镜（SEM）、衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）、流变学、基于FRESH方法的挤出式3D打印，以及体外细胞培养，系统评估了各配方的力学性能、稳定性、微观结构、流变行为、打印性和细胞相容性。结果表明，SF掺入显著增强了压缩模量和质量保留性，改善了打印形状保真度，并支持细胞活力。这为无需超声的胶原-SF复合水凝胶制备提供了新途径。
关键技术方法如下：酸性I型牛胶原（6.2 mg/mL，购自Advanced Biomatrix）和冻干再生SF购自同一供应商。主要技术包括：UVA介导RF/SPS光交联（365 nm，17 mW/cm2，5 min）；未超声SF直接掺入；单轴压缩测试（Discovery HR30流变仪，压缩速率5 mm/min）；7天在1× PBS中质量保留实验；SEM观察冷冻干燥样品；ATR-FTIR分析酰胺带；流变剪切扫描（0.001–100 s
-1）；FRESH方法3D打印（BIO X6生物打印机，明胶支撑浴，22G喷嘴）；NIH 3T3成纤维细胞培养、活死染色、Alamar Blue代谢检测及共聚焦形态观察。
结果如下：
3.1 单轴压缩性能评估：压缩测试显示所有水凝胶呈非线性J型应力-应变响应。在40%应变下，UXL-C的压缩应力最低（0.6±0.2 kPa），XL-C为1.6±0.9 kPa（无显著差异），XL-CS 1:1和1:2分别显著升高至3.4±2.3 kPa和5.7±1.9 kPa。压缩模量同样显著提高：XL-CS 1:1为9.2±3.4 kPa，XL-CS 1:2为16.1±8.5 kPa，均高于UXL-C（1.8±0.3 kPa）和XL-C（4.7±2.7 kPa）。表明双修饰显著增强压缩性能。
3.2 稳定性评估：7天质量保留实验中，UXL-C在第3天损失约50%，第7天仅保留约30%；XL-C与UXL-C类似；而XL-CS 1:1和1:2在第7天保留约45%，显著高于胶原-only组。表明SF掺入显著提高结构稳定性。
3.3 微观结构评估：SEM显示UXL-C具有随机取向的胶原纤维网络，且呈混浊外观；XL-C缺乏混浊，呈平滑膜状结构，说明RF/SPS抑制了胶原自组装；XL-CS呈致密片状形态，无纤维特征，但出现混浊。表明光交联和SF掺入改变纳米级组织。
3.4 ATR-FTIR评估：UXL-C显示酰胺I（1650 cm
-1）和酰胺II（1553 cm
-1）带。XL-C的酰胺I移至1638 cm
-1，酰胺II移至1540 cm
-1，表明分子环境改变和交联形成。XL-CS 1:2进一步移至1626和1533 cm
-1，落入β-折叠富集SF区域，且1448 cm
-1带增强，表明SF掺入促进β-折叠样有序结构和胶原-丝素相互作用。
3.5 流变特性评估：所有配方在0.01–100 s
-1剪切范围内呈剪切变稀。SF组在低剪切速率（0.01–0.1 s
-1）下粘度显著高于UXL-C和XL-C。在1 s
-1下，XL-CS组粘度约0.55 Pa·s，显著高于UXL-C（约0.3 Pa·s），与XL-C（约0.41 Pa·s）无显著差异。表明SF提高墨水粘度且不破坏剪切变稀。
3.6 打印保真度评估：使用FRESH打印方形网格时，UXL-C墨水在支撑浴融化后无法保持形状；XL-C打印结构形状不规则；XL-CS结构良好、丝宽均匀。定量分析显示，XL-CS 1:2的孔面积（27.2±4.5 mm2）显著高于XL-C（10.9±7.7 mm2），说明SF改善打印保真度。
3.7 体外细胞表征：活死染色显示所有组细胞存活率高，仅少量死亡。Alamar Blue显示各组代谢活性随时间增加，但XL-C第7天较其他组低。共聚焦显示细胞呈纺锤形，形态稳定，第7天接近汇合。表明所有配方支持细胞活力和增殖。
讨论部分：研究人员发现单独UVA-RF/SPS光交联未改善力学和稳定性，可能因为RF/SPS添加剂在90 min孵育期间抑制了热诱导胶原自组装，导致形成非纤维状膜结构，抵消了交联收益。而加入未超声SF后，环境光下RF可能诱导SF分子聚集，UV-A进一步促进β-折叠转变，形成物理交联的胶原/SF互穿网络（interpenetrating protein networks，IPNs），从而增强力学和稳定性。虽然SF组总蛋白含量更高，但力学增强呈非线性，表明主要贡献来自双修饰协同和物理增强。打印方面，SF提高粘度和结构完整性，改善形状保真度，但孔面积仍小于理论值，未来可添加粘度增强剂。细胞方面，XL-C代谢较低可能源于弱力学和非纤维结构导致细胞介导收缩，而XL-CS整合了胶原生物活性和SF机械增强，支持细胞黏附与增殖。
结论：本研究证明了通过UVA介导RF/SPS光交联与未超声SF掺入双重修饰胶原水凝胶，可协同增强复合胶原-SF水凝胶的力学性能、稳定性和3D打印性。UVA-RF/SPS单独交联虽改变了微结构，但未显著增强性能；与SF结合后显著强化蛋白基质，提高压缩模量和稳定性，改善打印保真度，同时保留细胞黏附表位。机制涉及RF介导SF颗粒聚集和β-折叠转变。所有配方支持细胞活力和增殖。未来需优化UV-A暴露参数和β-折叠控制，并评估包埋原代细胞。
