ADAMTS17 新复合杂合变异 c.1655G>A 与 c.450+38C>A 相关 Weill-Marchesani 综合征4：深内含子变异剪接致病机制及全基因组测序诊断价值

《Laboratory Investigation》：Identification of 2 Novel Compound Heterozygous ADAMTS17 Variants Associated With Weill-Marchesani Syndrome 4

目的：Weill-Marchesani 综合征4（WMS4）在标准外显子组测序未能检测到非编码致病性变异时经常被漏诊。研究人员旨在鉴定一名疑似WMS4患者的遗传病因，并表征 ADAMTS17 中一个深内含子变异导致剪接改变的机制。
材料与方法：对先证者进行全外显子组测序（WES）联合全基因组测序（WGS）；该先证者表现出WMS4的眼部和骨骼表现。应用小基因剪接试验（minigene splicing assay）验证该深内含子变异引起的剪接异常。
结果：患者表现为高度近视、短指、生长速度加快和骨龄提前。鉴定出 ADAMTS17 中2个新复合杂合变异，c.1655G>A 和 c.450+38C>A。深内含子变异 c.450+38C>A 经小基因试验证实，通过诱导35个碱基对的内含子片段保留，破坏正常前体信使RNA（pre-mRNA）剪接，导致移码和提前终止（p.G152Lfs?23）。
结论：该研究拓宽了 ADAMTS17 的变异谱。全基因组测序联合功能性剪接验证对于解决 WMS4 分子未确诊病例至关重要，尤其是在怀疑深内含子变异时，并支持遗传性结缔组织病的临床基因检测和遗传咨询。

论文围绕一例临床疑似 Weill-Marchesani 综合征4（WMS4）患者，综合全外显子组测序（WES）、全基因组测序（WGS）和小基因剪接试验，鉴定 ADAMTS17 两个新复合杂合变异，并证明深内含子变异 c.450+38C>A 通过异常剪接致病。Weill-Marchesani 综合征（WMS）是一种罕见遗传性结缔组织病，临床异质性显著，经典三联征为矮身材、短指（brachydactyly）和多种眼部异常，部分患者伴心血管受累。眼部异常突出且致残，包括高度近视、晶状体异位、小球形晶状体（microspherophakia）、闭角型青光眼和白内障，源于眼部组织重塑和细胞外基质（ECM）稳态缺陷。短指常累及双手足，与矮身材和关节僵硬相关。心脏受累如瓣膜病或肺动脉狭窄在部分患者中有报道。遗传上，WMS 可为常染色体显性和隐性；显性多由 FBN1 变异引起，隐性相关 ADAMTS10（WMS1）、LTBP2（WMS3）和 ADAMTS17（WMS4）。WMS4 由 ADAMTS17 双等位基因致病变异驱动，该基因编码 ADAMTS 家族分泌型金属蛋白酶，参与 ECM 组装、组织形态发生和器官发育。目前大多数 ADAMTS17 致病变异为外显子变异（无义、移码和错义），深内含子变异因常规 WES 捕获范围外而未被充分表征，导致诊断效率降低，部分典型 WMS 表型患者分子诊断未明。因此研究人员对一例疑似 WMS4 患者进行 WES 联合 WGS，并用功能性剪接验证深内含子变异，以明确遗传病因并扩展变异谱。

研究人员纳入该先证者及其未患父母，进行临床评估、眼科检查和影像学检查，采集外周血提取基因组 DNA。研究获北京 Jiaen Hospital 伦理委员会批准（BJH-2025022），符合赫尔辛基宣言，取得知情同意。关键方法包括：WES 和 WGS 检测先证者变异，Sanger 测序验证并在父母中进行家系共分离分析；按美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南并整合 gnomAD（人群频率数据库）、共分离和功能剪接证据进行致病性分类；构建携带 ADAMTS17 exon1-intron2-exon3 片段的小基因质粒，在 HEK293T 细胞中进行小基因剪接试验，以评估 c.450+38C>A 对前体 mRNA 剪接的影响。样本队列来源为先证者及未患父母外周血。

Clinical Features。通过临床、眼科、系统评估和影像，患者表现经典 WMS4 眼骨骼表型。睫状肌麻痹验光显示双眼高度近视伴散光，未矫正视力0.05，最佳矫正视力右眼1.0-1，左眼1.0-2；检查眼压（IOP）21 mmHg，既往峰值右31、左30 mmHg，2% carteolol 滴眼后控制于16-21和15-21 mmHg。眼底后极部正常，杯盘比约0.3，视网膜血管完整；前节角膜透明，无明显晶状体脱位。超声生物显微镜（UBM）显示极浅前房，中央深度右1.34 mm、左1.43 mm，伴虹膜膨隆和房角关闭，无明显晶状体移位，晶状体相对厚（右4.31 mm、左4.33 mm）。眼生物测量轴长正常。光谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）黄斑和视盘无结构异常。标准自动视野计显示双眼轻度弥漫性视野缺损，左眼稍重，整体功能保留。系统评估：身高正常但生长速度加快；7.7岁时身高125.8 cm（32.8百分位），体重34 kg（92.1百分位），BMI 21.5 kg/m²，符合肥胖；骨龄9.5岁，明显提前。2025年1月身高140 cm、体重46 kg，23个月年化生长速度约7.4 cm/y，超过同龄男孩平均约5-6 cm/y。2024年11月内分泌检查显示性激素结合球蛋白、雌二醇、促卵泡激素和催乳素正常，促黄体生成素和睾酮低，孕酮升高；未测生长激素和胰岛素样生长因子1。体检发现双手足短指，无其他系统畸形。患者否认心悸、胸痛、呼吸困难，父母报告无晕厥或运动不耐受；因合作有限未做正式超声心动图。基于这些发现诊断 WMS4。

Genetic Findings。通过核型、微阵列比较基因组杂交、WGS、Sanger 和小基因试验得出遗传结论。先证者核型46,XY，微阵列比较基因组杂交正常，无临床显著拷贝数变异。WGS 鉴定 ADAMTS17 两个新杂合变异：c.1655G>A（exon 12）和 c.450+38C>A（intron 2）。按 ACMG，c.1655G>A 引入提前终止密码子 p.W552?，分类为可能致病变异（PVS1+PM2_Supporting）。c.450+38C>A 初始为意义未明变异（VUS；PM2_Supporting+PM3）。Sanger 家系验证显示 c.1655G>A 来自父亲，c.450+38C>A 来自母亲，确认复合杂合。因 c.450+38C>A 位于 intron 2 经典供体位点下游38 bp，超出标准计算机剪接预测可靠评估范围，研究人员进行小基因剪接试验。逆转录PCR（RT-PCR）产物琼脂糖凝胶电泳显示野生型构建产生预期687 bp 片段，突变型产生额外722 bp 异常产物。Sanger 测序确认该变异诱导 exon 2 和 exon 3 之间35 bp 内含子片段保留（NM_139057.4:c.450+1_450+35ins），导致移码和 ADAMTS17 转录本提前终止 p.G152Lfs?23。结合家系共分离，c.450+38C>A 被重分类为可能致病变异（PS3+PP1）。c.1655G>A 位于已有其他致病变异的外显子12，而深内含子 c.450+38C>A 位于既往未报道区域。

讨论总结。研究人员在经典 WMS4 患者中鉴定两个新复合杂合 ADAMTS17 变异：无义 c.1655G>A（p.W552?）和深内含子 c.450+38C>A。后者位于标准 WES 捕获区外，仅由 WGS 检出，提示外显子组检测后仍有相当比例 WMS4 未解决。患者核心眼骨骼特征与已报道 WMS4 一致。与最大自然史研究（61例 WMS4，21例 ADAMTS17 变异）比较，眼部异常普遍，但矮身材仅73%，说明矮身材有特征性但非诊断必需；该患者身高正常仍属已知表型谱。晶状体双侧增厚但无明确脱位，与近期3年随访显示异位前进行性增厚一致，提示小球形晶状体可能先于半脱位，早期诊断可行，及时干预可预防继发性青光眼。加速生长和骨龄提前及肥胖应视为单例探索性观察，非确立 WMS4 特征。ADAMTS17 表达于生长板软骨，参与骨骼生成中 ECM 重塑；双等位功能丧失可能干扰纵向骨生长，但机制尚不清；BMI 升高是否真实代谢效应或巧合需进一步研究。内分泌低促黄体生成素和睾酮、高孕酮，但未测生长激素和 IGF-1，建议随访专项检测。两个变异均预测导致 ADAMTS17 功能丧失；无义和深内含子移码均产生提前终止密码子，含此类密码子的转录本通常触发无义介导的 mRNA 降解（NMD），导致转录本降解和蛋白缺失；若异常 mRNA 逃逸降解并翻译，截短蛋白缺乏正常分泌和 ECM 底物结合所需 C 端结构域，预期无功能。深内含子变异的功能验证至关重要，否则复合杂合诊断不完整、分子病因未明。研究支持小基因剪接试验用于确认基因组测序发现的内含子变异致病性。诊断策略上，对表型提示但外显子测序仅发现1个或无杂合编码变异者，应考虑 WGS 探查深内含子和其他非编码区；大规模研究已显示结构和非编码变异提高罕见病临床基因组测序诊断率，功能剪接验证对确认这类变异致病性必要。WGS联合小基因策略为 WMS4 分子诊断不完整提供实用方案，并可扩展到其他深内含子变异被外显子测序系统性漏检的结缔组织病。遗传咨询方面：应为高危家庭成员提供携带者检测，患儿父母均应检测以确认携带状态和相位；WMS4 为常染色体隐性病，两名携带者每次妊娠复发风险25%，应讨论产前诊断或植入前遗传学检测；因深内含子变异会被外显子检测漏检，未来患病或携带家庭成员的分子确认应使用覆盖该变异的检测；鉴于眼部表型进展性，建议患者早期规律眼科随访，包括眼压监测和晶状体评估，并纳入咨询。局限：因合作有限未做超声心动图，不能仅凭无症状排除心脏受累，建议随访心脏评估，尤其 ADAMTS17 变异患者中部分有瓣膜病报道。小基因试验在 HEK293T 细胞中进行，不能完全复现眼或软骨组织剪接环境，尽管明确显示异常剪接，组织特异性效应幅度可能不同。该试验为定性评估，无生物学重复或密度定量；异常转录本经 Sanger 独立确认，但精确评估剪接效率仍需重复定量实验。加速生长和肥胖为单例观察，应作为探索性发现而非 WMS4 确立特征。

结论翻译：总之，研究人员在一名表现经典眼部和骨骼表型的 WMS4 患者中鉴定出2个新复合杂合 ADAMTS17 变异（c.1655G>A 和 c.450+38C>A）。功能性剪接验证证实深内含子 c.450+38C>A 变异破坏前体 mRNA 加工。这些发现扩展 ADAMTS17 变异谱，并证明 WGS 联合功能性剪接验证是标准外显子组测序后分子诊断不完整 WMS4 患者的关键诊断策略，为 WMS4 家系遗传咨询提供分子基础。论文作者为 Wen-Jing Ku、Yi-Feng Xu、Shun-Tao Jiao、Gang Yu、Jia-En Liu、Tian-Ying Wei、Hua-Ying Hu、Feng Zhang。