《Laboratory Investigation》：Direct Measurement and Artificial Intelligence–Based Inference Reveal Histological Section Thickness as a Variable Physical Property Accessible From Routine Hematoxylin and Eosin Images
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目的：常规苏木精-伊红（H&E）图像的变异性是诊断病理学和计算病理学中日益受到关注的问题。尽管染色变异性已被广泛研究，组织学切片厚度在很大程度上仍是一种未得到测量的物理属性，可能影响图像表现。研究人员探讨了切片厚度在组织学切片内部及切片之间的变化情况，以及能否
目的：常规苏木精-伊红（H&E）图像的变异性是诊断病理学和计算病理学中日益受到关注的问题。尽管染色变异性已被广泛研究，组织学切片厚度在很大程度上仍是一种未得到测量的物理属性，可能影响图像表现。研究人员探讨了切片厚度在组织学切片内部及切片之间的变化情况，以及能否利用人工智能（AI）从H&E图像中推断切片厚度。
材料与方法：研究人员将高分辨率共聚焦表面轮廓测量与匹配的H&E成像相结合。在154个测量位点，将切片厚度与切片机预设值进行比较，并比较石蜡包埋状态与脱蜡状态下的厚度。使用357对匹配的图像-测量数据对开发AI模型，并在包含56幅图像的独立测试集中进行评估。
结果：石蜡包埋切片厚度经常偏离切片机预设值，超过三分之二的测量值超出标称设定值的±10%。脱蜡后，切片厚度减少至石蜡包埋厚度的大约三分之一。空间厚度图进一步揭示了组织成分依赖性的厚度减少，包括胶原、黏液、富含红细胞区域和核结构，导致脱蜡切片厚度出现显著的空间异质性。在基于卷积神经网络的回归模型中，性能最佳的ResNet50在独立测试集中实现了0.86的决定系数和0.28 μm的平均绝对误差。生成对抗网络进一步从H&E图像中重现了厚度变化的空间模式。数字颜色扰动分析表明，染色相关的图像变异可影响厚度估计。
结论：这些发现表明，组织学切片厚度不仅仅是切片机的设定参数，而是常规H&E切片的一种可变的、组织依赖性的且可通过AI推断的物理属性。因此，切片厚度可能是一种未被充分认识的前分析阶段图像变异来源，也是数字病理学中AI辅助的、厚度感知的质量控制的潜在靶点。
组织学切片厚度是影响病理图像外观的关键物理参数，但长期以来在常规病理工作中被默认为等同于切片机预设值，缺乏实际测量手段，其在数字病理学中作为领域偏移潜在来源的作用未获充分认识。本研究通过整合高分辨率共聚焦表面轮廓测量与匹配的H&E成像，系统评估了石蜡包埋及脱蜡状态下切片厚度的实际变化规律，并探索了利用深度学习从常规单焦点明场H&E图像中定量推断切片厚度的可行性。
研究人员利用共聚焦扫描显微镜获取154个位点的三维表面高度数据，比较实测厚度与切片机预设值的偏差，并分析脱蜡前后厚度及表面纹理的变化。在357对图像-厚度数据上训练VGG16、ResNet18、ResNet50三种卷积神经网络回归模型，同时在56幅独立测试图像上评估性能。此外，采用基于pix2pix框架的生成对抗网络(GAN)从H&E图像重建像素级厚度热图，并通过数字颜色扰动实验检验颜色变异对厚度推断的影响。
研究结果显示，石蜡包埋切片实测厚度经常偏离预设值，超过三分之二的测量点超出±10%范围；脱蜡后厚度降至石蜡状态的三分之一，且减少程度呈组织成分依赖性，富含红细胞、致密胶原及异染色质核的结构保留较多厚度，而黏液、细胶原纤维及常染色质核区域厚度损失更显著。功率谱密度分析证实脱蜡后表面高频成分增加，反映了组织微细结构的暴露。在厚度推断方面，三个CNN模型均能从H&E图像预测平均厚度，其中ResNet50性能最佳，R2=0.86，MAE=0.28 μm；GAN生成的热图与实测厚度图在空间模式上高度一致，转换为平均厚度后R2=0.84，MAE=0.29 μm。组织分层分析显示模型对训练中未出现的组织学分区仍保持预测能力；颜色扰动测试提示染色强度变化可系统性地影响厚度估计，但中等程度的色调偏移下模型相对稳定。
讨论部分强调，切片厚度偏离预设值是普遍现象，涉及不同切片机和操作者，脱蜡引起的组织成分依赖性收缩构成切片内厚度异质性的重要来源，常规显微镜下观察到的局灶性对焦差异与此一致。厚度相关信息隐含于标准H&E图像中，可通过深度学习恢复，但颜色归一化等处理可能同时改变携带厚度信息的图像特征。研究者提出厚度推断可用于厚度感知的质量控制、数据集分层以及提高AI模型对领域偏移的鲁棒性，并讨论了扩展到全玻片成像、免疫组织化学及未染色切片等方向的潜力。局限性包括单中心受控条件验证、染色变异真实性有限、组织类型覆盖不足以及未涉及盖玻片等其它前分析变量。
研究结论翻译：总之，研究人员证明了石蜡切片厚度可显著偏离切片机预设值，且脱蜡会引起组织成分依赖性的厚度减少，导致单个切片内出现显著的空间异质性。这些发现将切片厚度确立为并非固定的机械设置，而是每个切片固有的可变物理属性。研究人员进一步表明，利用深度学习可从常规单焦点明场H&E图像定量推断切片厚度，指示厚度相关信息隐含于标准组织学图像中并可被计算性恢复。综上，这些结果将切片厚度定位为数字病理学中一种可测量、可推断的变异来源，对质量控制、数据集分层以及未来改进模型鲁棒性和应对领域偏移的厚度感知策略具有潜在意义。
