《European Journal of Human Genetics》：RNA sequencing significantly improves HYDIN diagnosis and defines the effects of common deletions in primary ciliary dyskinesia
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原发性纤毛运动障碍（Primary Ciliary Dyskinesia, PCD）是一种罕见遗传性疾病，约影响1:7500个体，其特征为反复慢性呼吸道感染、支气管扩张、偏侧性缺陷和不孕。尽管已有至少60个PCD致病基因被报道，约30%的患者仍未获得确切的分子
原发性纤毛运动障碍（Primary Ciliary Dyskinesia, PCD）是一种罕见遗传性疾病，约影响1:7500个体，其特征为反复慢性呼吸道感染、支气管扩张、偏侧性缺陷和不孕。尽管已有至少60个PCD致病基因被报道，约30%的患者仍未获得确切的分子诊断。由双等位基因HYDIN变异引起的PCD因存在98%同源的假基因（HYDIN2）而难以诊断。此外，由于电子显微镜下无法观察到明显的HYDIN纤毛超微结构缺陷，功能性纤毛诊断检测可能无法得出明确结论。本研究旨在利用RNA测序（RNA-seq）对临床高度怀疑HYDIN缺陷但遗传学未确诊的PCD患者进行诊断。研究人员从患者鼻上皮细胞经气液界面培养21天后提取总RNA进行RNA-seq。采用rMATS检测剪接异常，并使用Integrative Genome Viewer手动检查基因组比对读段。共13例个体具有强烈的PCD临床怀疑、正常透射电镜（TEM）结果和不确定的遗传学发现：其中11/13例在HYDIN中携带单个致病性或可能致病性变异，1/13例无变异，1/13例需澄清变异来源（HYDIN vs HYDIN2）。RNA-seq解决了11/13例（85%）的诊断。七例无亲缘关系的患者中出现相同的复杂致病性异常剪接事件。这种异常剪接模式由一个跨越内含子17至内含子18的大片段10千碱基缺失引起。RNA-seq提高了疑似PCD患者的诊断率，并揭示了一个HYDIN“热点”变异，增加了观察到的HYDIN相关病例在我们遗传确诊队列中的患病率。常规PCD基因组学检测现在将纳入对该HYDIN遗传区域的调查。
一、研究背景与问题
原发性纤毛运动障碍（PCD）是一种罕见的遗传性运动纤毛疾病，全球发病率约为1:7500，患者表现为反复慢性呼吸道感染、支气管扩张、偏侧性缺陷及不孕。目前已鉴定至少60个PCD致病基因，但仍有约30%患者无法获得确切的分子诊断。HYDIN基因编码纤毛轴丝中央鞘C2b亚基蛋白，其双等位基因变异导致的PCD诊断尤为困难。主要原因包括：一是存在位于不同染色体且不在肺部表达的98%同源假基因HYDIN2，导致DNA序列读段错配和假阳性变异识别；二是HYDIN缺陷患者在透射电镜（TEM）下纤毛超微结构表现正常，缺乏典型结构缺陷；三是尚无商业化抗体可可靠定位HYDIN蛋白至纤毛轴丝。因此，HYDIN相关PCD被认为严重漏诊，部分国家甚至将其排除在基因检测之外。RNA测序（RNA-seq）作为一种补充工具，可通过检测异常剪接和差异表达来提升罕见病诊断率。
二、研究方法
研究人员对来自英国南安普顿和西南汉普郡研究伦理委员会批准的13例“高度可能”或“疑似”PCD患者（含一对受累同胞）进行研究。所有患者均接受临床检查、鼻一氧化氮（nNO）测量、高速视频分析（HSVA）、免疫荧光（IF）标记和TEM等标准诊断流程。基因检测由Wessex基因组学实验室服务和皇家布朗普顿与哈雷菲尔德医院临床遗传学与基因组学实验室完成。RNA-seq方面，从患者鼻上皮细胞经气液界面（ALI）培养21天后提取总RNA，使用Illumina HiSeq2500平台进行150bp双端测序（测序深度7000万读段），采用STAR比对至GRCh38参考基因组，并通过掩蔽HYDIN2区域消除干扰。使用rMATS-turbo检测异常剪接，Integrative Genomics Viewer（IGV）手动验证。长读长RNA测序采用PacBio平台进行正交验证。
三、研究结果
1. 临床特征与功能检测
所有13例患者均符合PCD临床表现，均有鼻窦和耳部疾病、慢性湿咳和新生儿呼吸窘迫（P4除外），所有患者内脏位置正常。nNO低于诊断阈值77 nL/min（P2除外）。TEM显示所有患者纤毛超微结构正常，但PCD-Detect-TEM图像平均化处理显示9例患者中央装置体积缺损，3例结果不明确，1例中央装置完整。HSVA显示所有患者纤毛摆动幅度减小、缺乏协调性，伴有半环形运动和静止纤毛。抗SPEF2免疫荧光定位在11例患者中减弱或缺失，但P6原代活检标本显示正常定位而ALI培养后消失，P13则始终显示正常定位。
2. 基因检测结果
PCD基因面板检测后，11/13例患者仅检出单个HYDIN致病性或可能致病性变异，1例无任何PCD基因变异，1例两个变异均位于与HYDIN2完全同源的外显子区域而无法判读。
3. RNA-seq诊断结果
RNA-seq成功解决11/13例（85%）的分子诊断。七例无亲缘关系患者（P1-P8）呈现相同的三种新型剪接事件：外显子18跳跃、内含子18内两个新受体位点和一个新供体位点。进一步研究发现这些事件由一个跨越内含子17部分、外显子18和内含子18部分的大片段缺失引起，断裂点定位于chr16:71051500-71061418，所有患者断裂点完全相同。长读长RNA测序提供了正交支持证据。P5（面板阴性）除该复发缺失外还鉴定出一个经典剪接变异NM_001270974.2:c.12652-1G>C，在内含子74内创建新受体位点。P9和P12通过异常剪接信号鉴定出第二变异：P9显示外显子27跳跃（后续全基因组测序证实为外显子27缺失），P12显示外显子21跳跃上调（由NM_001270974.2:c.3043-1G>A引起）。这两个剪接变异虽存在于原始数据但因位于与HYDIN2完全同源区域而被生物信息学管道过滤掉。P10和P8需确认先前鉴定的两个变异究竟位于HYDIN还是HYDIN2：RNA-seq证实P10的两个变异均为HYDIN变异，P8的重复位于HYDIN而缺失实际位于HYDIN2。
四、讨论与结论
RNA-seq成功鉴定并确认了致病性HYDIN剪接改变变异，解决了这一“TEM正常”队列的分子诊断。研究发现一个HYDIN“热点”缺失（c.2376+752_2529+9004del），占本队列半数以上病例，该缺失已在ClinVar登记（VCV003027480.1）并曾在Genomics England队列和Fleming等人的研究中报告。值得注意的是，该缺失携带者均具有相同断裂点，提示源于单一祖先变异且为血统同一（identical by descent）。RNA-seq显示该缺失产生框内和移码转录本的混合物，表明其作为低效等位基因（hypomorphic allele）发挥作用，解释了多名患者中SPEF2定位保留或减弱的表型。SPEF2免疫荧光在P6（携带错义变异与缺失反式组合）和P13（尚未获得分子诊断）中显示正常定位，提示“假阴性”正常定位可发生于低效变异或未解决表型中，强调功能性检测的复杂性。研究结论认为，RNA-seq是提升罕见遗传病遗传诊断的重要互补工具，应纳入未解决或不完全遗传发现的PCD诊断路径，尤其对于临床特征提示HYDIN相关PCD的患者。基于该缺失精确断裂点开发的快速DNA靶向检测已被纳入常规诊断流程。ERS/ATS指南推荐鼻刷取细胞用于标准诊断工作流程，因此预留细胞用于RNA-seq无需额外采样，有助于推动更多患者参与这类研究。
