Tryptoline立体探针远端修饰鉴定GRPEL1–HSPA9复合物抑制剂

《Nature Chemical Biology》：Tryptoline stereoprobe elaboration identifies inhibitors of the GRPEL1–HSPA9 complex

　　

基于活性的蛋白质组分析（activity-based protein profiling，ABPP）已鉴定出数百种来自不同类别的人类蛋白质，这些蛋白质能够与立体化学定义的电亲性化合物（立体探针，stereoprobes）在半胱氨酸残基上发生反应。然而，这些立体探针–蛋白质相互作用背后的构效关系仍知之甚少。本研究表明，色胺啉丙烯酰胺立体探针（tryptoline acrylamide stereoprobes）的蛋白质相互作用景观可被丙烯酰胺反应基团远端的结构修饰深刻改变。大多数立体探针连接事件发生在非正构位点（nonorthosteric sites），并且绕开了基于机器学习的共折叠模型Boltz-2的分配；该模型反而倾向于将立体探针错置于正构口袋中（研究人员将这种结果称为“正构性倦怠”，orthostery burnout）。研究人员发现，与核苷酸交换因子GRPEL1中C124反应的立体探针会破坏其与线粒体HSP70伴侣蛋白HSPA9/mortalin的相互作用，导致线粒体蛋白质导入受损和线粒体自噬诱导。研究结果凸显了色胺啉丙烯酰胺作为靶向蛋白质非正构位点的共价配体的多功能来源，包括扰动线粒体HSP70伴侣系统的工具化合物。

人类蛋白质组中绝大多数蛋白质缺乏高选择性的化学探针，尤其是对于难以纯化或缺乏明确结合口袋的蛋白质，小分子配体的发现面临重大挑战。基于活性的蛋白质组分析（activity-based protein profiling，ABPP）能够在天然生物体系中直接评估小分子与内源蛋白质的反应，为发现靶向动态、受调控蛋白质结构域和复合物的配体提供了独特途径。以往ABPP研究多使用亲电片段，但这类片段通常效力低、选择性差。为改善这一状况，研究人员构建了基于刚性sp³碳核心的立体探针（stereoprobes）文库，其中色胺啉丙烯酰胺（tryptoline acrylamide）类立体探针在人类蛋白质组中展现出广泛的立体选择性相互作用，但其远端结构修饰如何影响蛋白质相互作用图谱，以及现代机器学习共折叠模型能否预测这类共价配体事件，仍不清楚。为此，研究人员设计并合成了八组在色胺啉核心C6或C7位带有不同取代基（苯乙炔、苯并二氧杂环、氟苯醚、N-甲基三唑等）的立体探针，通过半胱氨酸导向的ABPP在Ramos人B淋巴瘤细胞中系统绘制配体可及性图谱，并进一步评估Boltz-2与AlphaFold3的预测能力，最终聚焦于GRPEL1–HSPA9复合物的功能扰动。这项研究发表在《Nature Chemical Biology》。

研究人员使用的主要技术方法包括：半胱氨酸导向的ABPP（以碘乙酰胺–脱硫生物素（IA–DTB）探针竞争结合，结合串联质谱标签（TMT）定量）在Ramos细胞中定量超过24,000个半胱氨酸；蛋白导向的ABPP与凝胶ABPP用于验证立体选择性、化学选择性和位点特异性；免疫沉淀–质谱（IP–MS）和免疫印迹检测GRPEL1–HSPA9相互作用；脉冲稳定同位素标记氨基酸培养（pulse-SILAC）定量蛋白质组学评估线粒体蛋白导入；Seahorse细胞外通量分析测定线粒体呼吸；mt-mKeima报告基因结合流式细胞术检测线粒体自噬；整合应激反应（ISR）通过免疫印迹检测ATF4和CHOP；结构预测采用Boltz-2和AlphaFold3共折叠分析。纯化的重组人GRPEL1和HSPA9蛋白由大肠杆菌LOBSTR菌株表达。

**配体可及性图谱（Ligandability maps of elaborated tryptoline acrylamides）**：通过半胱氨酸导向ABPP，研究人员在Ramos细胞中鉴定了95个被延伸立体探针结合的半胱氨酸，其中54个相比于母体探针被优先结合（>1.5倍），且大多数结合事件表现出对C6或C7修饰位置的强偏好，甚至在相同位置内也偏好特定取代基类型。所有四种立体异构体均结合不同的半胱氨酸集合，但反式异构体结合的半胱氨酸数量更多，表明远端取代基深刻改变了色胺啉丙烯酰胺的蛋白质反应图谱。

**Boltz-2对立体探针结合蛋白的分析（Boltz-2 analysis of stereoprobe-liganded proteins）**：研究人员对102个蛋白与32个立体探针的组合进行了Boltz-2共折叠预测，共产生1,710个模型。仅23个蛋白存在至少一个预测结构将配体放置在已知结合半胱氨酸的5?范围内。成功预测大多对应具有注释正构位点的蛋白，且当已知半胱氨酸本身位于正构位点内时预测成功率极高；而当半胱氨酸位于非正构位点时，Boltz-2几乎总是将配体错误放置在正构口袋中，即“正构性倦怠”。即使预先在正构位点填入已知配体（如来那度胺、K252a），也无法纠正这种错误。此外，Boltz-2不能从预测结构中区分活性与非活性对映体，对立体构型的预测没有富集实验确定的异构体。AlphaFold3同样仅表现出有限的预测能力。

**立体探针–半胱氨酸相互作用的表征（Characterization of stereoprobe–cysteine interactions）**：研究人员验证了FBL C268与WX-72d的立体选择性和位点特异性反应，并发现S-腺苷甲硫氨酸（SAM）共处理反而增强而非削弱WX-72d-yne与FBL的反应，提示该结合口袋位于SAM口袋附近但不重叠。对于非正构位点结合事件，重组蛋白凝胶ABPP确认了TEX264、NCKAPL1和GRPEL1的立体选择性、位点特异性共价修饰。在GRPEL1中，WX-71b和WX-71c对映选择性地标记C124，而不标记C124A突变体。非亲电性的丙酰胺类似物不能竞争炔基探针与BTK、ANKMY2或GRPEL1的反应，表明立体探针的效力主要来自共价反应，可逆结合则显著贡献了反应的选择性。

**立体探针破坏GRPEL1–HSPA9蛋白复合物（Stereoprobes disrupt the GRPEL1–HSPA9 protein complex）**：IP–MS和免疫印迹实验显示，WX-71b而非无活性对映体WX-71d，在表达野生型GRPEL1的HCT-116细胞中破坏GRPEL1与HSPA9的结合，且该效应依赖C124。反向IP–MS也证实了这一立体选择性破坏。纯化蛋白实验中，WX-71b可位点特异性地标记GRPEL1，而预孵育HSPA9可阻断标记，说明共价修饰GRPEL1 C124与HSPA9结合互斥。

**GRPEL1配体破坏线粒体蛋白导入（GRPEL1 ligands disrupt mitochondrial protein import）**：利用诱导型线粒体靶向序列–增强型绿色荧光蛋白（MTS–eGFP）报告系统，研究人员发现WX-71b处理8小时减少HCT-116细胞中线粒体蛋白导入，而WX-71d无效；在GRPEL1敲除背景下，表达WT-GRPEL1的细胞中WX-71b仍有效，而表达C124A突变体的细胞中效应大幅减弱。脉冲SILAC定量蛋白质组学显示，WX-71b处理的WT-GRPEL1细胞中重标记的新合成线粒体蛋白普遍减少，其中内膜和基质蛋白受影响最显著。Seahorse实验显示WX-71b立体选择性降低基础和最大呼吸，该效应在C124A细胞中减弱。WX-71b还立体选择性激活ISR标志物ATF4和CHOP，并增加mt-mKeima检测的线粒体自噬指数，而在C124A突变体细胞中这些效应均明显降低。

**总结与讨论**：该研究表明，色胺啉丙烯酰胺立体探针的远端取代基扩展可深刻改变其蛋白质相互作用图谱，产生大量靶向非正构位点的共价配体。Boltz-2等机器学习模型在正构位点共价结合事件预测中表现良好，但对非正构位点存在系统性错误定位倾向，需引入更多样化的训练数据以避免“正构性倦怠”。通过鉴定GRPEL1–HSPA9复合物抑制剂，研究人员展示了化学蛋白质组学从非正构位点发现功能工具化合物的潜力。这些配体可急性破坏GRPEL1–HSPA9相互作用，导致线粒体蛋白导入受损、呼吸抑制、ISR激活和线粒体自噬诱导，与HSPA9突变相关疾病的表型相呼应。研究结论可概括为：研究结果揭示了远端结构修饰对色胺啉丙烯酰胺立体探针蛋白质相互作用谱的深远影响，从而实现了靶向多种蛋白质非正构位点的配体发现，并为扰动线粒体HSP70伴侣系统提供了工具化合物。