《The Plant Journal》：A modular UDP-glycosyltransferase and cytochrome P450 system for soyasaponin C-22 modification
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大豆（Glycine max (L.) Merr.）产生的三萜类皂苷称为大豆皂苷（soyasaponins），根据其三萜骨架C-22位置的化学修饰可分为2,3-二氢-2,5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮（DDMP）皂苷和A组皂苷。这些C-22修饰赋予了
大豆（Glycine max (L.) Merr.）产生的三萜类皂苷称为大豆皂苷（soyasaponins），根据其三萜骨架C-22位置的化学修饰可分为2,3-二氢-2,5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮（DDMP）皂苷和A组皂苷。这些C-22修饰赋予了不同的生物学功能。尽管参与大豆皂苷生物合成的大多数基因已被鉴定，但负责将DDMP或阿拉伯糖（arabinose）偶联至C-22羟基的酶仍不清楚。本研究旨在鉴定参与这些修饰的酶。利用已知皂苷生物合成基因进行的共表达分析确定了三个候选UGT基因。其中，UGT73K5对大豆中DDMP皂苷的生物合成至关重要，因为ugt73k5突变体缺乏这些化合物。同样，百脉根（Lotus japonicus）中的直系同源基因UGT73K6也是DDMP皂苷生物合成所必需的，且ugt73k6缺陷可由大豆UGT73K5互补。此外，研究人员还鉴定出UGT73BU1（一个不与已知皂苷生物合成基因共表达的同源基因）是参与A组皂苷生物合成的C-22阿拉伯糖基转移酶（arabinosyltransferase）。在百脉根中，UGT73K6与一个负责C-22羟基化的细胞色素P450基因在基因组上共定位并共表达，形成了一个保守的生物合成基因簇。这种组织方式表明豆科植物中存在协调的DDMP皂苷生物合成模块。
研究背景与科学问题
大豆（Glycine max）种子富含蛋白质、油脂及多种次生代谢产物，其中大豆皂苷（soyasaponins）是一类重要的三萜类化合物。大豆皂苷根据其三萜骨架C-22位的化学修饰分为两类：DDMP皂苷（含有DDMP基团）和A组皂苷（含有阿拉伯糖链）。这两类皂苷具有截然不同的生物学功能：DDMP皂苷及其衍生物具有降胆固醇、抑制脂质过氧化和保肝等健康促进作用，而A组皂苷则导致豆制品产生苦涩后味。此外，它们在组织分布上也存在差异——DDMP皂苷积累于根、叶、种皮下胚轴和子叶中，而A组皂苷主要存在于根和下胚轴中，暗示其生物合成或转运受到空间调控。
尽管大豆皂苷生物合成途径的大部分步骤已被阐明，包括β-香树脂醇合酶（β-amyrin synthase）、多个细胞色素P450单加氧酶（CYP）以及多个UDP-糖基转移酶（UGT）的作用，但负责C-22位关键修饰的酶——即催化DDMP基团或阿拉伯糖基团连接到C-22羟基上的酶——仍未明确。此前的研究虽提出过一个候选DDMP转移酶，但其功能未经过互补验证。因此，鉴定这些关键的C-22修饰酶对于完整理解大豆皂苷生物合成途径、揭示其结构多样性的分子基础以及推动大豆品质改良具有重要意义。
研究内容与主要发现
研究人员采用共表达分析策略，结合反向遗传学筛选、异源物种功能互补实验、体外酶活测定以及比较基因组学分析，成功鉴定了催化大豆皂苷C-22位DDMP偶联和阿拉伯糖基化的两个关键UGT酶，并在百脉根中发现了由CYP和UGT组成的保守生物合成基因簇。
主要技术方法
- 1.
共表达网络分析：利用SoyNet数据库，以10个已知大豆皂苷生物合成基因为引导基因进行共表达分析。
- 2.
反向遗传学筛选：从高密度EMS诱变大豆突变体库（品种Enrei，约909个突变株系）中筛选目标基因的突变体，并通过LC-PDA-MS/MS分析皂苷组成。
- 3.
异源物种功能互补：利用百脉根（Lotus japonicus）发状根转化体系，将大豆候选基因转入百脉根突变体中进行功能回补验证。
- 4.
体外酶活测定：在大肠杆菌中表达重组蛋白，以纯化的底物Y3和UDP-阿拉伯糖进行酶促反应。
- 5.
比较基因组学与微共线性分析：对五种豆科植物（大豆、百脉根、蒺藜苜蓿、菜豆、赤小豆）进行基因组序列比对和微共线性分析。
研究结果
Identification of candidate C-22 UGTs by co-expression analysis（通过共表达分析鉴定候选C-22 UGT）
研究人员以10个已知皂苷生物合成基因为引导，在SoyNet网络中以Z-score≥250为阈值进行分析，鉴定出一个包含8个已知基因和3个未知功能基因的网络。这三个未知基因（Glyma.15G221300, Glyma.16G033700, Glyma.18G208300）均编码预测的UGT，且在种子、根和根毛中优先表达，与已知皂苷合成基因的表达模式一致。
Saponin composition of loss-of-function mutants of candidate UGTs（候选UGT基因功能缺失突变体的皂苷组成）
通过对突变体库的筛选，研究人员发现Glyma.16G033700的错义突变体完全缺失DDMP皂苷峰（αg, βg, βa），但酸水解后仍能检测到大豆皂苷元B，表明突变体保留了合成三萜母核的能力但DDMP偶联缺陷。相比之下，Glyma.15G221300和Glyma.18G208300的无义突变体并未改变皂苷组成，从而确定Glyma.16G033700是唯一与DDMP皂苷生物合成相关的候选基因。
Genetic complementation of a DDMP saponin-deficient L. japonicus mutant by Glyma.16G033700（大豆Glyma.16G033700对DDMP皂苷缺陷型百脉根突变体的遗传互补）**
由于无法获得UDP-DDMP底物进行体外验证，研究人员利用同样产DDMP皂苷的模式豆科植物百脉根进行体内功能验证。百脉根中Glyma.16G033700的最接近同源基因为Lj3g3v3776600，其表达谱与已知皂苷合成基因高度相似。两个独立的LORE1逆转座子插入突变体均丧失了βg皂苷。将大豆Glyma.16G033700或百脉根Lj3g3v3776600通过发状根转化导入突变体后，βg的积累得到恢复，而空载体对照无此效果。这表明这两个基因编码功能等效的UGT，负责DDMP在C-22位的偶联。据此，研究人员分别将其命名为UGT73K5和UGT73K6。
Assignment of Glyma.08G348500 as a C-22 arabinosyltransferase in vivo（鉴定Glyma.08G348500为体内C-22阿拉伯糖基转移酶）**
系统发育分析显示，Glyma.08G348500与UGT73K5的亲缘关系比与其他已知皂苷UGT更近。此前研究中发现的三个突变体（类别6）缺乏A组皂苷Ab和Ac，却积累了两种新化合物Y3和Y4。测序发现其中两个突变体携带Glyma.08G348500的错义突变，且与Y3/Y4表型共分离。体外酶活实验证实，重组Glyma.08G348500蛋白能以Y3为受体、UDP-阿拉伯糖为供体，特异性地生成阿拉伯糖基化产物（Y3-Ara），而对其他UDP-糖供体无活性。因此，该酶被命名为UGT73BU1，催化大豆皂苷元A衍生皂苷C-22羟基的阿拉伯糖基化。
The C-22 hydroxylase gene is located adjacent to UGT73K6 in the L. japonicus genome（百脉根基因组中C-22羟化酶基因位于UGT73K6邻近）**
研究人员发现，百脉根中UGT73K6附近存在一个CYP基因Lj3g3v3776580，两者相距约3.1 kb。该CYP是大豆C-22羟化酶GmCYP72A61的最接近同源物。两个独立的LORE1插入突变体缺失了βg，反而积累了一种新型化合物X4。X4的分子量比大豆皂苷Bb少16 Da，预测为缺少C-22羟基的Bb类似物。酵母异源表达证明Lj3g3v3776580确实具有C-22羟化酶活性。发状根互补实验也证实表达Lj3g3v3776580或GmCYP72A61均可恢复βg积累并消除X4。因此，Lj3g3v3776580被命名为LjCYP72A61。由此，百脉根中LjCYP72A61与UGT73K6形成了一个催化DDMP皂苷生物合成连续两步反应的基因簇。
Microsynteny of legume genomic regions containing UGT and CYP genes involved in DDMP saponin biosynthesis（含DDMP皂苷生物合成相关UGT和CYP基因的豆科基因组区域微共线性）
比较基因组学分析表明，百脉根和蒺藜苜蓿中CYP72A61与UGT73K家族基因紧密连锁形成基因簇。而在大豆、菜豆和赤小豆中，这两个基因位于不同染色体上，但在各自所在的区域仍保持着广泛的微共线性。这种差异与豆科植物的进化分支相一致：属于Hologalegina分支的物种（如百脉根、苜蓿）保留了基因簇，而属于Millettioid分支的物种（如大豆、菜豆）则发生了基因组分离。这表明CYP72A61与UGT73K5同源物的基因组分离发生在Millettioid谱系的演化过程中。
讨论与结论
本研究表明，共表达分析是发现皂苷生物合成途径中未知基因的有效策略。研究人员通过该方法成功鉴定出催化大豆皂苷C-22位DDMP偶联的UGT73K5和催化C-22位阿拉伯糖基化的UGT73BU1。虽然UGT73K5的体外酶活因无法获得UDP-DDMP底物而未能直接验证，但通过百脉根突变体互补实验提供了确凿的遗传证据。值得注意的是，DDMP皂苷和A组皂苷途径的分支点可能受不同的转录调控机制控制，这与蒺藜苜蓿中TSAR1和TSAR2分别调控非溶血性和溶血性皂苷途径的现象类似。此外，百脉根中CYP72A61与UGT73K6形成的基因簇以及它们在内质网的共定位，支持了C-22羟基化和DDMP偶联的协同功能。尽管大豆中这两个基因不在同一染色体上，但它们仍然共表达，表明协调的转录调控在不同豆科植物中是保守的。综合而言，本研究不仅填补了大豆皂苷C-22修饰关键酶的空白，还为利用这些遗传资源深入探究大豆皂苷的生理功能、食品品质贡献及人类健康效益提供了重要平台。
