查尔酮异构酶催化景观的快照：动态构象重排的结构证据

《Plant Direct》：Snapshots From the Catalytic Landscape of Chalcone Isomerase

　　

查尔酮异构酶（CHI）催化黄酮类化合物（一类对营养和疾病预防具有重要意义的植物天然产物）的三环骨架环化。一个长期存在的问题是，该酶是否利用蛋白质动态来促进底物在活性位点内的构象重排。为帮助解答该问题，研究人员将来源于蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的CHI与根皮素（phloretin，一种不能发生环化的柔性底物类似物）共结晶，并解析至2.0 ?分辨率。该晶体结构不对称单元含八个蛋白质分子，揭示了不同的活性位点构象，这些构象可容纳不同的根皮素结合构象体。这些结构快照共同描绘了一系列协调的、动态的化学相互作用，这些相互作用降低了底物在接近成键过程中的重排能垒。差示扫描荧光技术（DSF）结合突变分析和酶动力学进一步证实，根皮素可结合于酶活性位点，并作为CHI的竞争性抑制剂。综上，这些发现解答了关于CHI催化灵活性与动态性的悬而未决的问题，这些信息可能对未来生物合成设计和酶工程改造具有应用价值。总体而言，本工作支持一种催化模型：CHI酶作为一个动态结构集合（dynamic ensemble）发挥作用，该集合是促进催化底物重排所必需的。

查尔酮异构酶（CHI）催化黄酮类化合物生物合成中查尔酮底物的分子内环化，形成黄烷酮的三环骨架。黄酮类化合物是一类重要的植物天然产物，广泛参与植物生理功能并在人类营养与疾病预防中发挥重要作用。长期以来，围绕CHI催化机制的核心争论在于：酶是否利用蛋白质动态来促进底物在活性位点内的构象重排？查尔酮底物环化需要从热力学稳定的s-cis二烯构象转变为空间位阻较大但可环化的s-trans二烯构象。分子动力学模拟对此提出了两种竞争性模型：一种认为CHI活性位点能结合s-cis构象底物，并促进其在活性位点内发生重排；另一种则认为CHI仅能直接结合s-trans构象底物。然而，一直缺乏直接的实验证据来区分这两种模型。此外，先前获得的产物结合态CHI晶体结构仅提供静态图像，无法揭示活性位点动态如何促进底物重排。基于这些问题，研究人员选择来自蒺藜苜蓿的I型CHI（MtCHI-I），利用根皮素（一种还原的二氢查尔酮，因缺乏烯烃官能团而不能被CHI环化，但保留底物的柔性旋转自由度）作为底物类似物，进行了晶体学、生物物理和酶动力学研究。研究人员解析了MtCHI-I与根皮素复合物的2.0 ?分辨率晶体结构，发现不对称单元中八个蛋白质分子呈现不同的活性位点构象，能够分别稳定根皮素的不同结合构象体，从而捕捉到从非生产性近基态到环化近攻击态的一系列中间构象。该研究首次提供了CHI活性位点通过动态构象变化促进底物重排的结构证据，支持了“酶作为动态结构集合催化底物重排”的模型，解答了关于CHI催化动态性的悬而未决的问题，并为黄酮类化合物的生物合成设计、酶工程改造及理解相关酶家族进化机制提供了重要理论基础。

在技术方法上，研究人员在大肠杆菌BL21 DE3-pRIL细胞中重组表达并纯化了野生型MtCHI-I及其活性位点突变体（R37K、T49A、Y107F、S193A）；利用差示扫描荧光技术（DSF）测定根皮素、异甘草素及柚皮素与MtCHI-I的结合亲和力（K_d）与最大热位移（ΔT_m^max）；采用X射线晶体学方法，将根皮素浸泡至预形成的MtCHI-I晶体中，在先进光源（Advanced Light Source）束线8.2.1和8.2.2收集衍射数据，通过分子置换解析结构；同时结合稳态酶动力学实验，通过双倒数作图判断抑制类型并计算抑制常数（K_i）。样本来源为蒺藜苜蓿（M. truncatula）的I型CHI基因（UniProt: B7FJK3）。

**2.1 选择根皮素作为晶体学研究用底物类似物**
通过DSF比较三种化合物与MtCHI-I的结合，结果表明根皮素产生最强的热稳定效应（ΔT_m^max=9.8±1.0°C），表观K_d=26±1μM；异甘草素的ΔT_m^max=4.2±0.3°C，K_d=131±68μM；柚皮素的ΔT_m^max=4.1±0.1°C，K_d=598±161μM。因此，根皮素是相对较强的MtCHI-I结合剂和稳定剂，适合作为底物类似物用于晶体浸泡实验。

**2.2 CHI催化可塑性的晶体学见解**
通过X射线晶体结构解析（PDB：38KF），不对称单元中的八个MtCHI-I分子两两比较的C_α原子均方根（RMS）偏差值为0.168~0.596?，显示整体构象差异。底物根皮素绕二面角2旋转，使得与环化相关的(Ph)2′O…(Ph)C3原子间距离从mol. D的3.98?逐渐缩短至mol. B的3.09?，对应从非生产性s-cis构象到环化近攻击s-trans构象的转变。催化精氨酸R37的胍基在不同构象中提供动态氢键网络，尤其(R37)Nη2与(Ph)2′O的相互作用在所有构象中持续存在，用于稳定环化氧的负电荷态并引导质子转移。此外，T49、S193和Y107侧链稳定A环的位置和取向。

**2.3 MtCHI-I活性位点内根皮素结合的溶液研究**
为验证晶体结构中观察到的氢键相互作用，研究人员测试了Y107F、S193A、R37K、T49A四个突变体的DSF结合曲线。结果显示，T49A、R37K、S193A均导致ΔT_m^max降低和K_d升高，表明这些位点对根皮素结合有重要贡献；而Y107F与野生型类似，提示Tyr107的作用不显著。这与先前这些突变体降低催化效率的动力学结果基本一致。

**2.4 根皮素是MtCHI-I的竞争性抑制剂**
稳态酶动力学实验以2′,4,4′,6′-四羟基查尔酮为底物，在不同根皮素浓度下测定初速度。双倒数Lineweaver-Burk图显示，增加根皮素浓度导致表观K_m增大，而V_max不变，表明根皮素以竞争性方式抑制MtCHI-I。三个抑制剂浓度下计算的平均K_i为32±4μM，与DSF所得K_d（26±1μM）吻合。

在讨论部分，本研究的发现直接支持了Hur等人提出的动态催化模型，即CHI活性位点能够稳定底物的非生产性构象，并通过动态相互作用促进其向环化生产性构象重排。同时，研究扩展了先前关于催化精氨酸在CHI进化中通过侧链胍基快速移动而获得催化能力的发现。本工作仅针对I型CHI，而早期模型基于II型CHI；但近年来已证实催化精氨酸在这两类CHI中均不可或缺，尽管其空间位置存在差异。在应用层面，黄酮类化合物生物合成途径具有丰富的化学多样性和工程价值，CHI折叠蛋白在自然界中表现出高度功能可塑性，为新型生物催化剂的理性设计提供了起点。此外，根皮素作为CHI的竞争性抑制剂，可能在苹果等产生二氢查尔酮的物种中形成负反馈调节，且根皮素也能抑制肠道微生物Eubacterium ramulus的CHI，表明其抑制活性具有广泛性。

研究结论可概括为：总之，本研究首次提供了CHI活性位点内查尔酮环化动态过程的结构证据，该过程由底物与催化精氨酸的协同移动直接促进。该工作更新了CHI动态催化的模型，对未来生物催化设计目标具有重要指导意义。