《Prenatal Diagnosis》：Non-Invasive Prenatal Diagnosis of Haemoglobinopathies: From Concept to Clinical Reality
血红蛋白病是全球最常见的一类单基因疾病，显著增加了儿童期的发病率和死亡率。在已建立相关规划的地区，包括携带者筛查和产前诊断在内的预防策略已成功降低了疾病发病率。然而，目前确定性的产前诊断仍依赖侵入性操作，如绒毛膜绒毛取样和羊膜腔穿刺，这些操作带来虽小但显著的流产风险。无创产前诊断（non-invasive prenatal diagnosis, NIPD）提供了一种潜在替代方案，能够实现更早诊断并消除操作相关的流产风险。本叙述性综述探讨了血红蛋白病的遗传基础与全球负担、当前的筛查策略及已确立的侵入性诊断方法，进而批判性地评估了针对镰状细胞病和地中海贫血的NIPD发展现状。研究人员总结了主要的方法学路径，包括相对单倍型剂量（relative haplotype dosage, RHDO）和相对突变剂量（relative mutation dosage, RMD），并回顾了已发表研究和临床试验的证据。尽管多种NIPD策略显示出有前景的结果，但仍存在胎儿分数变异、技术复杂性、成本和准确性等挑战。此外，在筛查和诊断服务的可及性方面，全球范围内仍存在显著的不平等，尤其是在疾病负担较重的地区。尽管NIPD可能提高产前诊断的可接受性和采用率，但其在血红蛋白病中的常规临床应用仍需进一步验证，以证明其持续稳定的高诊断准确性，同时实现方法学标准化并降低成本。
1 引言
血红蛋白病是一组由血红蛋白结构或生成异常导致的遗传性血液疾病。结构变异源于珠蛋白链的质变，如镰状细胞病（sickle cell disease, SCD）；定量障碍则以珠蛋白链生成减少或缺如为特征，如地中海贫血。血红蛋白病是全球最常见的单基因疾病。全球约5.2%的人口携带具有临床意义的血红蛋白变异，估计每年有50万例受影响的出生。历史上，血红蛋白病在撒哈拉以南非洲、地中海盆地、中东和南亚地区患病率最高；然而，全球移民的增加导致携带者人群的扩散。因此，血红蛋白病在世界范围内显著增加了儿童发病率和死亡率。严重表型需要终身临床管理，包括输血治疗、铁螯合治疗和专科多学科护理，这给社会经济和医疗系统带来了沉重负担，尤其是在资源有限地区。
为应对血红蛋白病的高患病率和临床严重性，预防策略已成为公共卫生举措的核心。产前携带者筛查规划可识别有生育患病子女风险的夫妇，而产前诊断则有助于知情的生殖决策，并已被证明可降低严重血红蛋白病的发病率。然而，目前确定性诊断依赖侵入性操作，包括绒毛膜绒毛取样和羊膜腔穿刺，两者均具有虽小但临床显著的流产风险。相关的流产风险虽然较低，但可能限制准父母的接受度和采用率。对更安全、更可接受的诊断替代方案的追求，推动了基于母血浆中细胞游离胎儿DNA（cell-free fetal DNA, cffDNA）分析的NIPD方法的发展。
2 血红蛋白病的遗传基础与临床影响
2.1 镰状细胞病
SCD是一种常染色体隐性遗传的结构性血红蛋白病，全球约影响310万人。其由β-珠蛋白基因（HBB）中的单核苷酸替换引起，导致β-珠蛋白链改变，产生血红蛋白S（HbS）而非成人血红蛋白（HbA）。在脱氧条件下，HbS聚合，导致红细胞变形、血管闭塞和器官损伤。疼痛发作是SCD患者住院的主要原因，并对心理健康、教育和就业产生负面影响。疾病严重程度因基因型而异，从无症状的HbAS携带状态到更严重的纯合HbSS疾病。2000年至2021年间，每年受影响的出生人数从约45.3万增加到51.5万，反映了人口增长和生存率的提高。尽管治疗取得了进展，SCD仍与高儿童死亡率相关。最高负担集中在少数国家，估计50%的HbAS和HbSS出生发生在仅三个国家：尼日利亚、印度和刚果民主共和国。
2.2 地中海贫血
地中海贫血是血红蛋白合成的定量障碍，其特征在于HbA的α-或β-珠蛋白链生成减少或缺如，分别导致α-或β-地中海贫血。临床严重程度因基因型而异，从无症状贫血到严重输血依赖性疾病或早期死亡。当地中海贫血与结构血红蛋白变异（包括血红蛋白S、C或E）共同遗传时，表型多样性进一步增加。最严重的α-地中海贫血类型——血红蛋白巴特氏（Hb Barts）由功能性α-珠蛋白基因完全缺失引起，导致严重贫血、胎儿水肿和晚期妊娠或出生后不久的新生儿死亡。此类妊娠与显著的母体并发症相关，如胎盘早剥和子痫前期。类似地，β-地中海贫血主要特征为幼儿期出现的严重贫血，导致发育迟缓和终身输血依赖。定期输血方案联合铁螯合治疗以预防铁过载的引入，显著提高了生存率和生活质量。超过一半的受影响个体预计可达50岁，伴随可观的长期医疗费用。
3 筛查
通过产前筛查早期识别血红蛋白病携带者夫妇，有助于及时的遗传咨询和知情的生殖决策。产前诊断进一步支持这些决策，特别是对于临床上显著的、累及β-珠蛋白基因的血红蛋白病，这类疾病在出生时通常无症状。这种延迟的临床表现反映了胎儿血红蛋白（HbF）在宫内生命和婴儿早期的主导地位，其含有不受β-珠蛋白基因致病变异影响的γ-珠蛋白链。出生后，从γ-珠蛋白到β-珠蛋白的生理性转换导致成人血红蛋白（HbA）生成增加；因此，受影响的婴儿在出生后第一年内开始出现症状。
全球范围内的血红蛋白病筛查策略各不相同，包括婚前、产前或新生儿筛查。在医学终止妊娠在文化和宗教上不太可接受的地区，婚前筛查已被广泛采用作为预防策略。伊朗、沙特阿拉伯和土耳其的国家婚前筛查规划旨在阻止高风险携带者婚姻，减少患病后代的孕育。相比之下，英国将孕早期产前携带者筛查与针对性伴侣检测相结合。当识别出高危夫妇时，提供侵入性产前诊断检测以指导决策。通用新生儿筛查则可实现对受影响婴儿的早期诊断和及时临床管理。
自20世纪70年代以来，塞浦路斯和希腊的长期筛查规划已将受影响出生减少高达90%。类似的效果也出现在中等收入国家，包括古巴的SCD出生人数减少10倍，以及黎巴嫩的类似结果。经济分析进一步支持筛查举措的成本效益，一项研究表明，通过筛查预防一例β-地中海贫血主要的成本低于一例受影响个体每年的治疗费用。
尽管取得了这些成功，全球差距仍然巨大。虽然许多地中海和中东国家维持产前筛查已有数十年，但SCD患病率最高的地区缺乏全面的国家筛查规划。尽管刚果民主共和国、尼日利亚和加纳已报告了新生儿筛查试点项目，但可持续的国家级规划仍然有限。
4 侵入性产前诊断
通过携带者筛查识别高危妊娠后，血红蛋白病的产前诊断目前依赖侵入性胎儿采样技术。金标准操作是绒毛膜绒毛取样（chorionic villus sampling, CVS）和羊膜腔穿刺，它们分别提供胎盘组织（通常代表胎儿基因型）和胎儿遗传物质。这些方法可实现高度准确的分子诊断，报告准确率超过99%。CVS在妊娠11周后进行，采用超声引导的经腹和经宫颈途径获取胎盘绒毛。其主要优势是能够在孕早期建立诊断，促进更早的生殖决策。操作技术的改进、操作者经验以及经腹途径的偏好已将操作相关流产风险降低至约0.2%–2%。羊膜腔穿刺在妊娠15周后通过经腹穿刺抽吸含有胎儿细胞的羊水进行。相关流产风险低于CVS，估计在0.11%至1%之间。然而，较晚的采样时间导致诊断延迟，这可能增加父母的心理负担，并与随着孕周增加产前诊断检测采用率降低相关。
样本采集后，根据疑似基因型采用多种分子诊断技术。大片段缺失约占α-地中海贫血病例的95%，Gap-PCR通过跨已知断点区域扩增以产生特征性大小的产物来检测这些变异。然而，该方法仅限于已知缺失，因为需要特异性引物。多重连接依赖性探针扩增（MLPA）常与之联合使用，因为它可定量基因拷贝数并检测已知和新型缺失。相比之下，大多数β-地中海贫血由HBB基因内的点突变引起。Sanger测序仍是检测序列变异的金标准，但其不能可靠地识别大片段缺失。在遗传同质且复发变异数量有限的人群中，靶向等位基因特异性方法，包括等位基因特异性PCR和反向点印迹，提供了快速且经济有效的替代方案。由于镰状细胞病由HBB中的单个点突变引起，其非常适合通过等位基因特异性PCR或Sanger测序检测。下一代测序（NGS）有潜力增强分子诊断，特别是在复杂病例中，但尚未被常规采用。在实践中，在致病变异数量有限的种族多样性较低的人群中，通常首选靶向突变分析；而在罕见变异更为普遍的遗传异质性人群中，则倾向于更广泛的测序方法。
5 血红蛋白病无创产前诊断的出现
NIPD分析母血样本，可在妊娠早期采集且无流产风险。它基于对母血浆中存在的细胞游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）的分析。cfDNA由短的非包裹性细胞外DNA片段组成，其中大部分源于母体（母体cfDNA），少数源于胎儿，主要由凋亡的胎盘滋养层细胞释放（cffDNA）。1997年，通过检测怀有男性胎儿的孕妇cfDNA中的Y序列，首次证明了母血中cffDNA的存在。cffDNA占母血浆中总cfDNA的百分比称为胎儿分数（fetal fraction）。胎儿分数是一个动态生物学参数，在不同患者之间和同一妊娠内具有显著变异性。在大多数10至20周的单胎妊娠中，胎儿分数在10%至15%之间；然而，其可低至3%。胎儿分数受母体BMI、年龄、产次、孕周和胎盘嵌合体等因素影响。
必须区分NIPD和无创产前筛查（non-invasive prenatal testing, NIPT）。NIPD是一种诊断性检测，可在高危妊娠中明确识别遗传病，例如有阳性家族史或特定超声发现的妊娠。相比之下，NIPT是一种筛查方法，估计胎儿患遗传病的风险，因此需要后续侵入性诊断检测以确认疾病。NIPD和NIPT的方法通常相同，虽然本文在NIPD背景下关注它们，但其中一些方法是为NIPT开发和使用的。NIPD目前仅适用于有限的临床应用，主要用于单基因疾病和胎儿性别确定。在英国，NIPD通过国家医疗服务体系（NHS）国家基因组检测目录为某些疾病公开提供。对于某些血红蛋白病，NIPD已在专业研究环境中进行研究，主要针对β-地中海贫血和SCD。然而，尽管在选定队列中显示出有前景的分析性能，这些方法尚未获准用于常规临床实践。
5.1 相对单倍型剂量分析
NIPD中使用的一种方法是相对单倍型剂量（RHDO）分析，其依赖于母体DNA和cffDNA的NGS。在某些方法中，还分析父方DNA。RHDO进一步需要使用先前患病或未患病的非携带者后代（称为先证者）的DNA进行单倍型定相。识别基因内或侧翼的信息性单核苷酸多态性（SNP），并与亲本单倍型定相，根据其与目标基因的连锁关系（通过已知先证者基因型确定）将其分类为低风险或高风险。然而，如果突变基因位点附近或在其位置发生重组事件，单倍型定相可能失败。
RHDO的一个主要限制是需要构建亲本单倍型，这通常依赖于先证者样本的可及性，因此限制了其在没有既往后代的家庭中的应用。近亲夫妇因共享亲本单倍型而进一步使RHDO复杂化。然而，这可以通过将类型5 SNP纳入算法来解决，这些SNP已被证明无论亲缘关系程度如何，都能实现准确的胎儿基因型预测。还开发了几种替代单倍型策略以直接确定亲本单倍型，包括高通量连锁读长测序、邻近连接靶向测序、长读长测序和半导体测序。然而，其中许多方法在技术上更为复杂，因此难以快速且经济有效地实施，这限制了其在临床环境中的使用。
5.2 相对突变剂量
另一种NIPD方法是相对突变剂量（RMD），其通过检测母血浆cfDNA中致病变异与野生型等位基因比率的失衡来推断胎儿基因型。母血浆DNA分析最常用数字PCR进行，但也使用了NGS。低浓度的cffDNA导致高错误率，促使研究团队开发数字核酸大小选择（NASS）以增加cffDNA分数浓度。RMD在检测大片段缺失突变时存在局限性，仅用于点突变或小缺失。RMD可用于携带相同类型地中海贫血的夫妇，虽然存在局限性，但可用于近亲夫妇。
基于这种等位基因失衡原理的进一步检测已开发出来，包括循环单分子扩增和重测序检测（CSMART）以及后来的条形码使能单分子检测方法（cfBEST）。CSMART由Lv等人开发，通过在应用循环扩增和重测序前用条形码标记单个DNA分子，提高了突变与野生型等位基因比率测定的准确性。cfBEST在扩增和NGS前使用条形码作为唯一分子标识符（UMI），以实现单分子等位基因计数。在β-地中海贫血诊断中，cfBEST在一项涉及143例妊娠的盲法验证研究中，敏感性为99.19%（95%置信区间（CI），97.62%–100%），特异性为99.92%（95% CI，99.82%–100%），出现1例假阴性和3例假阳性。该检测旨在寻找16种常见HBB致病变异。
5.3 局限性
母血浆中cffDNA的比例受多种因素影响，包括母体体重指数（BMI）、胎盘大小和功能、孕周和采样时间。BMI增加与胎儿分数降低相关。超重患者（BMI 25–29.9 kg/m
2）因胎儿分数不足而获得无结果结局的几率约为正常体重患者（BMI 18.5–24.9 kg/m
2）的2倍。在III级肥胖个体（BMI ≥ 40 kg/m
2）中，无结果结局的可能性进一步增加至8倍。母血浆中cffDNA的比例在一天中有所不同，下午水平更高。
一个主要问题源于大多数血红蛋白病是常染色体隐性遗传病，其中父母双方均为相同致病变异的携带者。这意味着目标变异也存在于母体细胞游离DNA的背景中。与可以通过其在母血浆中的存在而明确识别的从头变异或父源遗传变异不同，母源遗传变异需要能够检测等位基因平衡微小变化的高灵敏度技术。
双胎可影响NIPD结果的准确性，因为这些技术通常无法区分两种胎儿基因型。双胎妊娠中的另一个问题是，虽然双胎妊娠的总胎儿分数高于单胎妊娠，但每个胎儿的胎儿分数有所降低。另一个并发症是双胎消失综合征（VTS），即一个双胎在孕早期正常死亡。估计15%–35%的双胎妊娠因VTS而最终为单胎分娩。已消失双胎的cffDNA可在母血中持续释放长达15周，剩余的cffDNA可在NIPD检测中被检测到，尤其是在死亡后6周内。然而，cffDNA在分娩后不会在母血中持续存在，并在24小时内被清除至不可检测水平。
NIPD的临床实用性受成本、可及性和样本物流的影响。虽然单次NIPD检测的成本可能低于或与侵入性操作相当，具体取决于遗传病和方法，但开发提供常规NIPD所需的设施和专业知识需要大量前期投资，正如法国和英国整合基于cfDNA的产前服务所示。这些资源要求可能影响其融入公共医疗系统，可能限制其成为私人或商业可用服务。
5.4 商业应用
最后，NIPT已变得商业化，涵盖SCD和β-地中海贫血等遗传性疾病。这由Eurofins和UNITY（BillionToOne Inc.， Menlo Park， CA， USA）等公司提供。UNITY Screen采用RMD方法，检测四种常染色体隐性遗传病，包括α-和β-血红蛋白病。该检测报告敏感性为93.3%，阴性预测值为99.4%，阳性预测值为48.3%。然而，这些结果应谨慎解读，因为临床结局确认有限，研究中筛查的妊娠中只有一小部分具有可用的结局数据。虽然这些检测代表了向更广泛可及性迈出的重要一步，但它们尚未涵盖所有致病变异。其作用目前限于风险评估而非确定性诊断，当筛查显示胎儿高风险评分时需要确认性侵入性检测。另一个显著障碍是患者的个人费用。
6 讨论
尽管在血红蛋白病的预防和管理方面取得了进展，但在携带者筛查和产前诊断服务的可及性方面，全球不平等现象依然存在。已建立公共卫生规划的地区表明，系统筛查和产前诊断可以降低严重血红蛋白病的发病率。相比之下，疾病负担最重的地区往往缺乏类似的基础设施，反映了疾病患病率与医疗可及性之间的不匹配。因此，由于分子实验室能力有限、经济限制、社会污名和缺乏认知，产前诊断在研究环境之外很少进行。
NIPD有潜力解决其中一些因素。通过实现更早诊断、消除操作相关流产风险且仅需母血样本，它提供了一种更安全且可能更可及、更可接受的替代方案。这可能在侵入性采样操作专业知识更为有限的低资源或农村环境中尤其重要。NIPD还避免了在无病毒抑制情况下侵入性操作相关的HIV垂直传播风险，加强了其在HIV高流行地区的潜在益处。
尽管概念吸引人且结果有前景，NIPD尚不能立即用于血红蛋白病的全球常规实施。主要挑战仍在于实现与已确立的侵入性技术相当的一致高诊断准确性。NIPT常规用于13、18和21三体筛查，而NIPD已用于多种单基因疾病。在英国，NIPD在NHS内用于由从头或父源遗传变异引起的常染色体显性遗传病、囊性纤维化的父源排除检测以及选定的常染色体隐性遗传病。
用NIPD诊断血红蛋白病存在独特的技术挑战，包括cffDNA被母体DNA稀释以及获得可重复结果所需的胎儿分数。基于RHDO的NIPD比RMD方法具有更高的准确性，因为它使用多个连锁位点而非单个变异位点。然而，RHDO需要父方或先证者样本进行单倍型构建，限制了其在这些样本不可用时的应用。新兴的长读长测序技术可能无需依赖家系即可实现直接单倍型定相，有望提高RHDO的可扩展性和临床适用性。
成本也是一个关键障碍。样本分析所需的复杂实验室基础设施需要大量投资，尤其是在低收入地区和公共医疗系统中。值得注意的是，这些成本可能随时间推移被血红蛋白病相关医疗费用的减少所抵消。
社会因素（包括污名）影响产前检测的采用。血红蛋白病产前诊断的可及性并不一定能转化为疾病负担的相应比例下降。在一些地区，管理进展带来的临床结局改善与继续受影响妊娠的意愿增加相关。社会文化和宗教信仰也影响态度。在一些穆斯林占多数的国家，尽管有证据表明公众接受度相对较好，宗教和伦理信仰限制了产前诊断的可及性。缺乏认知是另一个障碍。在撒哈拉以南非洲的研究发现，如果NIPD可用且负担得起，参与者对其持开放态度。
尽管如此，NIPD可能通过提供更可接受的替代方案来提高采用率。一项调查利益相关者对SCD NIPD看法的研究发现，程序安全性是服务使用者（患者）最看重的属性，NIPD的预测采用率（93.8%）显著高于侵入性产前诊断（63.1%）。这突显了操作相关流产风险在患者决策中的重要性。
NIPD还可以解决婚前筛查采用率下降所造成的缺口。在塞浦路斯，向产前筛查的转变归因于民间婚姻和未婚夫妇的增加。尽管产后策略（包括英国的新生儿血斑检测和通过Generation Study进行的全基因组测序）有助于血红蛋白病的早期诊断，但这些发生在出生后。因此，在妊娠开始时整合NIPD可以促进更早的知情的生殖决策。
总之，血红蛋白病的NIPD已从单纯的概念发展为一种潜在可行的诊断方法。未来的努力应优先考虑诊断准确性、可负担性、技术简洁性和公平可及性，同时注重文化敏感性、遗传咨询以及对新兴商业检测的适当监管。采取整体方法对于实现NIPD作为预防血红蛋白病的安全、准确且可及工具的全部潜力至关重要。
