重症肌无力补体抑制剂疗效的潜在生物标志物：基于细胞实验的AChR结合IgG与膜攻击复合物沉积双阳性细胞比例预测价值研究

《Journal of the Neurological Sciences》：A potential biomarker for the efficacy of complement inhibitors in myasthenia gravis

一项生理学实验量化了AChR抗体阳性重症肌无力（MG）中的补体激活情况。流式细胞术同时检测了AChR结合IgG和膜攻击复合物（MAC）沉积。补体抑制剂应答者中AChR-IgG+/MAC+双阳性细胞比例更高。双阳性细胞可能在治疗启动前预测治疗应答。这些发现支持基于生物标志物的补体抑制剂患者筛选策略。

论文解读

一、研究背景与目的

重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是一种以骨骼肌易疲劳性无力为特征的自身免疫性疾病，其病理机制在于神经肌肉接头传递功能障碍。约80%的MG患者体内可检测到乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，AChR）抗体。目前临床常用的放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）所测定的AChR抗体滴度虽对MG诊断具有重要价值，且能在个体患者中反映疾病严重程度，但不同患者之间的抗体滴度与疾病严重程度并不呈平行关系。AChR抗体主要通过三种致病机制介导病理损伤：补体介导的突触后膜损伤、AChR的内化（抗原调节）以及抑制乙酰胆碱与AChR的结合。其中补体激活是AChR抗体阳性MG发病的关键机制之一，最终导致膜攻击复合物（membrane attack complex，MAC）的形成和神经肌肉接头的破坏。

补体抑制剂（包括依库珠单抗、ravulizumab和zilucoplan）近年来已获批并越来越多地用于AChR抗体阳性全身型MG的治疗。然而，约30%–40%的患者对补体抑制剂治疗应答不充分。既往研究虽已建立基于细胞的实验体系来评估MG中自身抗体结合AChR并通过MAC沉积激活补体的能力，但这些实验体系高度标准化：患者样本需经热灭活处理并补充固定来源的补体，且常使用缺乏补体调节因子的细胞系。因此，这些体系无法真实反映体内补体级联反应的全貌，而体内补体水平及调节机制的个体差异恰恰会影响补体激活过程。此外，此类细胞实验的结果与补体抑制剂临床应答之间的关系尚不明确。

基于上述背景，本研究旨在通过细胞实验评估AChR抗体结合AChR并诱导MAC形成的能力，从而寻找能够预测AChR抗体阳性MG患者对补体抑制剂治疗应答的生物标志物。

二、研究设计与主要技术方法

本研究为回顾性观察性研究，纳入2018年1月至2025年5月期间在日本千叶大学医院启动补体抑制剂（依库珠单抗、ravulizumab或zilucoplan）治疗的14例全身型AChR抗体阳性MG患者，并招募10例年龄和性别匹配的健康对照（healthy controls，HCs）。排除标准包括补体抑制剂启动前转为AChR抗体血清阴性者，以及评估期间发生可能影响MG症状或补体活性的合并感染（如COVID-19、肺炎、尿路感染等）者。患者血清样本在补体抑制剂启动前采集并储存于?80°C备用。

研究采用活细胞流式细胞术实验体系，以稳定表达成人型（2α, β, δ, ε）和胎儿型（2α, β, δ, γ）人AChR并共表达rapsyn的HEK293细胞为靶细胞。患者和健康对照血清不经热灭活处理，直接作为抗体和补体来源与细胞共孵育，且不添加外源性补体，以更接近体内生理状态。通过流式细胞术同时检测AChR结合IgG的平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）和MAC（C9新抗原）沉积MFI，并在单细胞水平上分析AChR结合IgG⁺/MAC沉积⁺双阳性细胞比例。阳性阈值设定为健康对照平均MFI加3个标准差。临床严重程度采用MG日常生活活动（MG-ADL）评分评估，应答者定义为治疗3个月后MG-ADL评分较基线改善至少3分的患者；基线MG-ADL评分低于2分的患者，应答定义为达到MG-ADL评分为0。

三、研究结果

3.1 患者基线特征

共纳入14例AChR抗体阳性全身型MG患者和10例年龄、性别匹配的健康对照。MG患者中位年龄41岁（IQR 35–50），中位病程7.3年，基线中位MG-ADL评分为9分，中位AChR抗体滴度为102 nmol/L。14例接受补体抑制剂治疗的患者中，11例被分类为应答者，3例为非应答者。

3.2 AChR结合IgG和MAC沉积

流式细胞术分析显示，MG患者的AChR结合IgG MFI显著高于健康对照（中位值4614 vs 172，中位差异4212，95% CI 1588–7451，P<0.001）。MAC沉积MFI同样在MG患者中显著升高（中位值488 vs 227，中位差异260，95% CI 59–495，P<0.001）。代表性直方图显示，健康对照的荧光分布窄而尖锐，而MG患者呈现右移且分布更宽的特征。

3.3 AChR结合IgG和MAC沉积双阳性细胞

在单细胞水平上，MG患者的AChR结合IgG⁺/MAC沉积⁺双阳性细胞比例显著高于健康对照（中位值75% vs 0%，中位差异65%，95% CI 18–82，P<0.001）。

3.4 流式细胞术参数与临床变量的相关性

基线MG-ADL评分仅与AChR结合IgG MFI相关（r_s=0.58，95% CI 0.05–0.85，P=0.033），而与MAC沉积MFI或双阳性细胞比例无显著相关。然而，MG-ADL改善程度与三个流式细胞术参数均显著相关：AChR结合IgG MFI（r_s=0.65，95% CI 0.17–0.88，P=0.013）、MAC沉积MFI（r_s=0.61，95% CI 0.10–0.87，P=0.022）以及双阳性细胞比例（r_s=0.70，95% CI 0.25–0.90，P=0.007）。相比之下，RIA测定的AChR抗体滴度与基线严重程度和临床改善均无显著相关。

3.5 应答者与非应答者的流式细胞术参数比较

应答者与非应答者之间的AChR结合IgG MFI（中位值5311 vs 330，P=0.088）和MAC沉积MFI（中位值533 vs 283，P=0.126）无统计学显著差异。然而，双阳性细胞比例在两组间存在显著差异：应答者中位值为74%，非应答者仅为0.2%（中位差异65%，95% CI 15–94，P=0.022）。

四、讨论与结论

本研究发现双阳性细胞比例在补体抑制剂应答者中显著高于非应答者，提示该参数可能作为预测临床应答的生物标志物。与既往采用热灭活血清和标准化补体来源的实验体系不同，本研究使用未经热灭活的血清作为抗体和补体来源，并保留HEK293细胞的内源性补体调节因子，更接近体内实际情况。研究未观察到MAC沉积MFI与基线MG-ADL评分的相关性，可能原因包括：个体间循环补体水平和调节能力的差异影响了MAC沉积的测量；基线MG-ADL评分反映的不仅是当前补体激活状态，还包含既往慢性损伤的累积效应；样本量较小限制了统计效能。

值得注意的是，双阳性细胞比例比单一MFI参数能更清晰地区分应答者与非应答者。这是因为MFI主要反映血清抗体的平均结合能力和补体激活能力，而双阳性细胞比例捕捉的是靶细胞中AChR充分结合与补体激活同时发生的细胞比例，这一双重条件可能更好地反映可被补体阻断剂抑制的补体介导损伤效率。

本研究存在以下局限性：回顾性设计、样本量较小且非应答者仅3例，限制了结果的普适性；应答者定义和实验阈值未经正式验证；非应答者组基线MG-ADL评分较低可能存在地板效应；未进行治疗前后的纵向采样；未对多重比较进行校正。因此，本研究结果应视为假说生成性质，需在独立的前瞻性队列中验证。

研究结论：在AChR抗体阳性MG患者中，AChR结合IgG⁺/MAC沉积⁺双阳性细胞比例与临床改善相关，且能最清晰地区分补体抑制剂应答者与非应答者。该参数可能作为指导MG患者补体抑制剂治疗选择和监测的潜在生物标志物。