MSMEI_4050表达状态调控Mycolicibacterium smegmatis对利福平的耐药性：过表达降低耐药而抑制增强耐药

《Journal of Global Antimicrobial Resistance》：MSMEI_4050 modulates resistance to the antitubercular drug rifampicin in Mycolicibacterium smegmatis

　　

MSMEI_4050调控Mycolicibacterium smegmatis（M. smegmatis，Msm）对抗结核药物利福平（rifampicin）的耐药性。MSMEI_4050基因过表达导致Msm中对利福平耐药性降低。MSMEI_4050基因抑制导致Msm中对利福平耐药性增加。分子对接（molecular docking）显示，MSMEI_4050蛋白不与利福平相互作用。

Arriaga-Guerrero等围绕Mycolicibacterium smegmatis（M. smegmatis，Msm）中MSMEI_4050基因与利福平（rifampicin）耐药性的关系开展研究。研究背景在于，结核病（tuberculosis, TB）由Mycobacterium tuberculosis引起，是单一感染性疾病致死的重要原因；2023年全球有1080万人患TB，125万人死亡，耐药TB从2017年160 684例增至2022年450 000例。耐药是多因素现象，包括卫生基础设施不足、治疗不充分、依从性差和再感染等。多药耐药（multidrug-resistant, MDR）TB主要由不同基因突变导致，但其他机制也参与，其中分枝杆菌细胞壁固有耐药是重要机制，该壁高度疏水且富含分枝菌酸。M. tuberculosis基因组含约250个脂质代谢相关酶，如Lip家族；该家族具有Gly-X-Ser-X-Gly共有序列和α/β水解酶折叠（alpha/beta hydrolase fold）。部分分枝杆菌脂肪酶与耐药相关；在M. smegmatis模型中，LipF过表达增加利福平和链霉素敏感性，LipX过表达赋予利福平、异烟肼和乙胺丁醇耐药性，LipG破坏引起细胞壁改变并降低利福平和异烟肼敏感性，NLH-H（Rv1399c）过表达降低对tetrahydrolipstatin（THL）的敏感性。此前在M. smegmatis mc²155中筛选M. tuberculosis脂肪酶直系同源物发现，MSMEI_4050（又称MSMEG_4148或MSMEI_RS20345）与NLH-H相似性超过30%，二者均曾称为LipH，编码推测的α/β水解酶，且NLH-H与细胞壁生物合成相关。因此，该研究旨在评估MSMEI_4050表达对M. smegmatis耐药性的影响，通过过表达或抑制该基因理解其与耐药现象的关系。研究得出结论：MSMEI_4050过表达导致M. smegmatis对利福平耐药性降低，而抑制该基因导致耐药性增加，分子对接显示MSMEI_4050蛋白不与利福平直接相互作用。该工作提示脂肪酶基因表达参与分枝杆菌耐药调控，对理解分枝杆菌家族耐药复杂机制及开发新治疗、诊断策略和全球抗抗生素耐药努力具有意义。

关键技术方法方面，研究未使用临床样本队列，主要基于Mycolicibacterium smegmatis mc²155（M. smegmatis，Msm）及Escherichia coli DH5α（E. coli）菌株。研究人员构建pMV261-MSMEI_4050过表达株和PLJR962-MSMEI_4050-gRNA的CRISPR干扰（CRISPR interference, CRISPRi）抑制株，并设置pMV261、PLJR962-control-gRNA与PLJR962-mmpL3-gRNA等对照；提取总RNA后进行逆转录（reverse transcription, RT）和定量PCR（quantitative PCR, qPCR）检测表达；采用刃天青微量滴定法（resazurin microtiter assay, REMA）测定最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC），结合生长曲线和菌落形成单位（colony-forming unit, CFU）存活实验评价药敏；利用AlphaFold预测MSMEI_4050三维结构，并用AutoDock Vina进行分子对接（molecular docking）分析其与利福平及vinyl caproate对照底物的相互作用。

研究结果如下。

3.1 Effects of MSMEI_4050 overexpression and inhibition in M. smegmatis：研究人员将pMV261-MSMEI_4050构建体转化M. smegmatis以评估过表达，RT-qPCR检测到MSMEI_4050表达较pMV261对照增加42倍。利用CRISPRi构建PLJR962-MSMEI_4050-gRNA转化株，在诱导剂anhydrotetracycline（ATc，脱水四环素，CRISPRi诱导剂）存在时观察到该基因抑制28%。CRISPRi表型评价显示，MSMEI_4050抑制不影响细菌生长；而对照mmpL3抑制在有无ATc时生长差异显著，证明CRISPRi系统有效。

3.2 Effect of MSMEI_4050 expression on M. smegmatis drug susceptibility：通过REMA测定药物敏感性，MSMEI_4050过表达时利福平MIC为0.6 μg/mL，低于pMV261对照的1.2 μg/mL和野生型M. smegmatis mc²155的6.4 μg/mL，表明过表达增加利福平敏感性。抑制株在ATc存在时MIC为1.6–3.2 μg/mL，PLJR962-control-gRNA为0.8–1.6 μg/mL，表明MSMEI_4050抑制增加利福平耐药性。生长动力学曲线显示，过表达株在利福平存在时生长低于pMV261对照；CFU存活实验也显示pMV261-MSMEI_4050株对利福平敏感性增加。抑制株在ATc存在时较无ATc时耐药性增加。PLJR962-control-gRNA在利福平有无ATc时动力学曲线无显著差异。野生型mc²155在含卡那霉素液体培养基中不生长。其他测试浓度下未观察到生长。异烟肼（isoniazid）、贝达喹啉（bedaquiline）、利奈唑胺（linezolid）和左氧氟沙星（levofloxacin）在生长动力学中未检测到中等变化。pMV261、无ATc的PLJR962-MSMEI_4050-gRNA和无ATc的PLJR962-control-gRNA作为主要实验对照；control-gRNA有生长变异，但有无ATc无显著差异。

3.3 Interaction between MSMEI_4050 and rifampicin：序列比对显示，M. smegmatis MSMEI_4050与M. tuberculosis NLH-H蛋白具有36.96%一致性，二者共享Ser-Asp-His催化三联体。AlphaFold生成MSMEI_4050三维结构，核心区pLDDT>90，活性位点包括Ser229、Asp323和His353。分子对接显示，MSMEI_4050与利福平的吉布斯自由能变化（ΔG_b）为143.96 kcal/mol，提示该蛋白-配体反应非自发，MSMEI_4050蛋白不与利福平直接相互作用；乙烯己酸酯（vinyl caproate）对照底物ΔG_b为?4.26，并与活性位点发生相互作用。

讨论部分指出，分枝杆菌脂质对其生存、毒力和细胞包膜重要，超过60%的分枝杆菌细胞壁含脂质，脂质和脂解酶参与细胞活力、毒力和细胞结构。MSMEI_4050是nlhH的直系同源物，更新后的MSMEI_4050序列长1 128 bp，较旧参考序列在上游5′区少15 bp；额外5个N端氨基酸不干扰活性位点。CRISPRi抑制28%低于理论预期，但与文献中15–40%抑制范围一致，且部分抑制arr基因也可改变M. smegmatis利福平敏感性。研究还比较了lipF、LipX、LipG、lipE等脂肪酶基因与耐药的关系，并指出脂酶与药物暴露后细胞壁结构变化、分枝菌膜糖肽脂和海藻糖二霉菌酸酯（trehalose dimycolates）水平增加相关。分子对接的ΔG_b大于零说明利福平不直接与MSMEI_4050蛋白相互作用，但与利福平耐药相关。未来研究方向包括互补实验、巨噬细胞感染模型、溴化乙锭摄取实验、SYTOX Green或碘化丙啶（propidium iodide, PI）方法以及比较脂质组学分析。

研究结论翻译：研究结果揭示MSMEI_4050表达在耐药中发挥作用，证明其在M. smegmatis中过表达导致利福平耐药性降低，而其抑制导致对该药物耐药性增加。阐明脂肪酶基因对抗生素耐药的具体贡献，不仅有助于理解分枝杆菌家族耐药性的复杂机制，也有助于当前对新耐药治疗、诊断策略以及全球抗击抗生素耐药性努力的认识。