机械传感器协同调控肝细胞癌中的DNA损伤修复

《Cancer Research》：Mechanosensors Collaborate to Regulate DNA Damage Repair in Hepatocellular Carcinoma

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摘要

基质硬度的增加是肝细胞癌（HCC）的一个生物力学特征，它作为推动肿瘤进展的重要促进因素。研究机械传感器及其驱动HCC的下游机制有助于识别潜在的治疗策略。在这项研究中，我们开发了一种标准程序来筛选和识别机械传感器，发现了两种HCC机械传感器SDC4和PKD2。这两种机械传感途径共同介导了由基质硬度促进的DNA损伤修复（DDR）。具体来说，SDC4和PKD2通过增加蛋白磷酸酶2A的组装和活性来调节基质硬度增加导致的BANF1核转位。随后，核内的BANF1增强了MRE11–RAD50–NBS1复合体的形成及其下游效应子的磷酸化，从而增强了DDR。这些发现不仅扩展了对基质硬度调控的DDR的理论理解，而且还提供了一种用于癌症中机械传感器筛选/识别的方法。

意义：基质硬度通过双重途径增强DNA修复，表明针对机械传感器之间的相互作用可能是克服细胞毒性药物抗性的潜在策略。

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引言

经导管动脉化疗栓塞（TACE）和肝动脉灌注化疗是治疗晚期肝细胞癌（HCC）的关键介入疗法，奥沙利铂是最常用的化疗药物（1）。奥沙利铂通过破坏DNA复制和转录及诱导双链断裂（DSB；参考文献2）来发挥其抗肿瘤作用。然而，奥沙利铂耐药性仍然是治疗晚期HCC的一个未解决挑战（3）。肿瘤细胞的DNA损伤修复（DDR）能力被认为是决定细胞毒性化疗疗效和敏感性的关键因素。先前的研究主要集中在肿瘤细胞自身在化疗耐药性中的作用，如基因突变（4）、代谢重编程（5）、氧化应激（6）、异常细胞周期和凋亡（7）以及干细胞特性（8）。近年来，肿瘤微环境对DDR的贡献受到了重视，包括缺氧（9）、乳酸积累（10）、癌相关成纤维细胞（11）和髓系来源的抑制细胞（12）。然而，微环境中生物力学信号对DDR的影响及其潜在机制仍大部分未知，缺乏新的机械传感器筛选/识别标准化途径和理想的硬度相关实验平台是两个重要的限制因素。基质硬度的增加是HCC的一个显著生物力学特征，现在被认为是推动HCC进展的关键促进因素（13）。通过应用已建立的硬度相关实验平台，我们之前验证了基质硬度的增加显著增强了HCC细胞的恶性特性，并促进了它们的侵袭和转移（14）。同时，整合素β1/α5（14）和Piezo1（15）作为机械传感器也被证实能够感知硬度信号，并将生物力学信号转化为生化信号。除了上述两种机械传感器外，关于HCC中是否存在其他新的机械传感器知之甚少。目前已知的机械传感器主要分为粘附分子/受体（整合素）和离子通道蛋白[Piezo1（15）和TRPV4（16）]；它们直接连接细胞外机械信号和细胞内生化反应。其他报道的分子，包括FAK（17）、Src（18）、YAP/TAZ（19）和Lamin A（20），仅是下游机械信号响应分子；严格来说，它们不能被定义为机械传感器。最近，使用珠子拉伸/磁镊子来确定粘附分子/受体机械传感器是否可以直接感知和传递内皮细胞中的机械信号（21）。结合荧光Ca2+指示剂的细胞拉伸装置也为验证离子通道蛋白是否感知细胞外机械信号提供了可能性（22）。这些新的直接验证方法无疑将有助于加速新机械传感器的发现。尽管已知基质硬度的增加对细胞毒性化疗耐药性有潜在影响（23），但从DDR的关键角度进行的直接机制分析仍然不足。Deng及其同事（24）最近报告称，基质硬度通过MAPK4/6/7激酶介导的泛素磷酸化作用，调节RNF8向RNF168、BRCA1和53BP1的招募，从而调节DDR。然而，该研究并未说明哪些上游分子对基质硬度刺激作出反应，以及不同机械传感途径之间是否存在协同调节。考虑到粘附分子/受体和离子通道蛋白代表两种不同的机械传感途径，我们推测在HCC中基质硬度增强的DNA修复过程中可能存在这两种机械传感途径之间的相互作用。在这里，我们开发了一种标准程序来筛选和识别HCC中的新机械传感器，并提出了一种新的调控机制，即这两种机械传感途径共同介导基质硬度促进的DDR。这些发现进一步完善了目前对基质硬度调控DDR的理解，并为发现HCC中的新机械传感器提供了新的思路。

材料与方法

细胞和细胞培养

人HCC细胞（MHCC97H，RRID：CVCL_4972）来自复旦大学中山医院肝癌研究所。人HCC细胞（Hep3B，RRID：CVCL_0326）和小鼠HCC细胞（Hepa1–6，RRID：CVCL_0327）购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所的细胞库。MHCC97H和Hepa1-6细胞在添加了10% FBS（BioSun；RRID：BS-0002）和1%青霉素-链霉素（GenomBio；RRID：GNM15140）的DMEM（GenomBio；RRID：GNM12800）中培养。Hep3B细胞在含有相同10% FBS和1%青霉素-链霉素补充物的最小必需培养基（GenomBio；RRID：GNM41500）中维持。使用的细胞保证无支原体，并通过短串联重复序列分析验证了其身份。

慢病毒和质粒转染

慢病毒载体（Homo-OE-SDC4、Homo-OE-PKD2、Homo-shSDC4、Homo-shPKD2、Mouse-shSDC4、Mouse-shPKD2）由Genechem有限公司设计、构建和包装。Hep3B细胞和MHCC97H细胞分别以10和20的感染复数（MOI）感染这些载体。Hepa1-6细胞以40的MOI感染含有Mouse-shSDC4或Mouse-shPKD2的载体。编码人类BANF1变体[野生型（WT）、BANF1去磷酸化质粒（MAAAQ）、BANF1过度磷酸化质粒（MDDDQ）、T3A/K54A/E83A/D86A、E83A/D86A]的质粒由Genechem有限公司制备。根据制造商的方案，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen；RRID：#3000015）将质粒转染到MHCC97H和Hep3B细胞中。所有过表达/敲低片段的序列见补充表S1。

胶原蛋白I包覆的聚丙烯酰胺凝胶基质，硬度分别为6 kPa和16 kPa

参考之前报道的方法（25），通过混合30%丙烯酰胺（Sigma-Aldrich；RRID：#A8887）、2%二丙烯酰胺（Sigma-Aldrich；RRID：#146072）、10%过硫酸铵（Sigma-Aldrich；RRID：#A3678）、四甲基亚乙基二胺（Beyotime Biotechnology；RRID：#ST728）和ddH2O（详细配方见补充表S2），制备了硬度为6 kPa（低，模拟正常肝脏的组织硬度）和16 kPa（高，模拟肝硬化肝脏的组织硬度）的聚丙烯酰胺（PA）凝胶基质。凝胶基质经过30分钟的UV照射处理，然后用0.8 mg/mL盐酸多巴胺[在50 mmol/L HEPES（pH 6.8–8.2）中]功能化（Servicebio；RRID：#G4210）。用1× PBS冲洗三次后，进一步用1 mL 0.1 mg/mL的胶原蛋白I（COL1；Corning；RRID：#CLS354236）涂覆凝胶基质。获得的COL1包覆的PA凝胶基质用于后续的细胞培养。

三维水凝胶培养系统

制备了一个具有不同硬度（6 kPa，低硬度；16 kPa，高硬度）的三维（3D）水凝胶培养系统，以模拟正常肝脏（6 kPa）和肝硬化肝脏（16 kPa）的组织硬度。通过混合4%改性海藻酸（Aladdin；RRID：#S100126）和100 mmol/L CaCl2（Aladdin；RRID：#C110766）以优化体积制备水凝胶。简要来说，将1克海藻酸与274毫克1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（Aladdin；RRID：#E106172）和484毫克N-羟基琥珀酰亚胺（Aladdin；RRID：#H109330）在100 mL 0.1 mol/L MES缓冲液中（Beyotime Biotechnology；RRID：#ST370）化学修饰。然后将活化的海藻酸与100毫克的GGGGRGDSP肽在室温下共价交联 overnight。所得的改性海藻酸使用3,500 Da MW截留值的透析膜进行大规模透析，无菌过滤并冻干。将改性海藻酸粉末溶解在DMEM中制备4%（w/v）的储备溶液。4%改性海藻酸溶液与HCC细胞悬浮液和100 mmol/L CaCl2溶液轻轻混合。混合物在37°C下完全凝胶化1小时。凝胶化后，去除多余的CaCl2，并加入1 mL的完整培养基。细胞在3D水凝胶系统中培养14天，然后进行后续实验分析。

Western blot

使用RIPA裂解液（Beyotime Biotechnology；RRID：#P0013B）提取细胞总蛋白。使用NE-PER核和细胞质提取试剂（Thermo Fisher Scientific；RRID：#78835）分离细胞核蛋白，使用Minute Plasma Membrane Protein Isolation Kit（Invent；RRID：#SM-005）制备细胞膜蛋白。使用BCA蛋白测定试剂盒定量蛋白质浓度。等量的蛋白质样品通过十二烷基硫酸钠-PA凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。用含有0.1% Tween 20的TBS封闭后，将膜在4°C下与稀释的一阶抗体孵育过夜，然后在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二级抗体孵育1小时。使用增强型化学发光检测试剂盒（Yeasen；RRID：#36222ES76）和ChemiDOC XRS成像系统（Bio-Rad）可视化蛋白条带。使用ImageJ软件（版本1.8.0）半定量分析条带强度。作为内部对照，总蛋白使用GAPDH或α-tubulin，核蛋白使用Lamin B1，膜蛋白使用Na+/K+–ATPase。

Western blot

肿瘤组织固定在4%甲醛中，用石蜡包埋，切成4-μm切片。脱蜡、水化和抗原修复后，切片用3% H2O2处理20分钟，然后用3%牛血清白蛋白（BSA）封闭30分钟。稀释的一阶抗体在4°C下与切片孵育过夜，随后在室温下与HRP标记的聚合成兔/小鼠二级抗体（Gene Tech；RRID：#GK6005）孵育30分钟。用DAB（Gene Tech；RRID：#GK6005）显色，然后用hematoxylin（Gene Tech；RRID：#GT1005）复染。使用光学显微镜（Olympus）捕捉图像。对于定量分析，每个切片选择五个随机视野，使用ImageJ软件（版本1.8.0）量化荧光强度。稀释的一阶抗体如下：LOX（Proteintech；RRID：#17958-1-AP，RRID：AB_2234541，1:200）、COL1A1（Proteintech；RRID：#67288-1-Ig，RRID：AB_2882554，1:200）、PKD2（Proteintech；RRID：#19126-1-AP，RRID：AB_10641050，1:100）和SDC4（Proteintech；RRID：#11820-1-AP，RRID：AB_2877797，1:100）。

免疫荧光

细胞切片用4%甲醛固定，用0.7% Triton X-100渗透15分钟，然后用PBS冲洗三次。然后在室温下用3% BSA封闭30分钟。封闭后，细胞在4°C下与稀释的一阶抗体孵育过夜，随后与适当的荧光二级抗体和4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育进行核复染。一阶抗体如下（来源，稀释度）：MRE11（Abcam；RRID：#ab214，RRID：AB_302859，1:100）、γ-H2AX（Abcam；RRID：#ab22551，RRID：AB_447150，1:100）和BANF1（Abcam；RRID：#ab129184，RRID：AB_11150422，1:100）。共聚焦图像是使用徕卡共聚焦显微镜（Leica Microsystems）拍摄的。常规荧光图像是使用奥林巴斯荧光显微镜（Olympus Corporation）获得的。为了定量分析，每张切片选择了五个随机视野，并使用ImageJ软件（版本1.8.0）对荧光强度进行了量化。肿瘤组织切片的免疫荧光（IF）染色采用了与免疫组织化学类似的方案，不同之处在于使用了荧光标记的二级抗体代替了酶偶联的二级抗体，并用DAPI对细胞核进行了复染。

qRT-PCR

细胞RNA是使用Trizol试剂（Thermo Fisher Scientific；产品编号#5596018）提取的。从最多1微克的总RNA中逆转录合成cDNA是使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific；产品编号#3438563）完成的。PCR扩增是使用Hieff qPCR SYBR Green Premix（Yeasen；产品编号#1202ES60）进行的。qRT-PCR是在QuantStudio 5仪器（Thermo Fisher Scientific）上进行的。所有反应都重复了三次。GAPDH被用作参考基因，通过ΔΔCT方法确定相对mRNA表达水平。引物序列显示在补充表S3中。

杨氏模量测量

我们利用上海交通大学Yuan Feng博士实验室的帮助，设计并实现了一种定制的压痕系统，用于表征基质硬度，具体细节已在之前的研究中详细说明（26）。简而言之，压痕运动由电动机（SMAC Corporation）驱动，而压头位移则通过激光位移传感器（HG-C1050，Panasonic）实时监测。传感器信号以1 kHz的频率采样，并通过数据采集板（PCI-1706U，Advantech Co., Ltd.）进行采集。基于LabVIEW（National Instruments）的定制图形用户界面（GUI）实现了自动压痕控制和实时数据收集。

根据之前描述的方法（21）和制造商的说明，4.5微米的Tosyl-激活的顺磁珠（Thermo Fisher Scientific，产品编号#14013）被涂覆了SCD4抗体（Santa Cruz Biotechnology，产品编号#sc-12766，RRID: AB_628314）或PLL（Beyotime Biotechnology；产品编号#C0313）。在使用前，这些磁珠需要在0.2摩尔/升Tris缓冲液（pH 7.4）中在室温下孵育过夜，以去除任何残留的甲磺酸基团。贴壁的HCC细胞与抗体涂层的磁珠在37°C下孵育30分钟，然后用1× PBS去除多余的磁珠。随后，与磁珠结合的HCC细胞受到磁场作用30分钟。与磁珠结合的细胞被收集用于后续实验。

细胞内Ca2+测量

细胞内钙离子浓度是使用Fluo-4 AM荧光探针（Beyotime Biotechnology）检测的。HCC细胞在高硬度或低硬度基底上培养48小时。培养基被丢弃后，细胞用1× PBS轻轻洗涤三次。然后细胞在37°C下与500微升4微摩尔/升的Fluo-4 AM工作溶液（在PBS中稀释）孵育30分钟。孵育后，用1× PBS洗涤三次去除多余的探针。荧光图像是使用奥林巴斯荧光显微镜（Olympus）拍摄的。为了定量分析，每组获取五个随机视野。平均荧光强度（MFI）使用ImageJ软件（版本1.8.0）进行分析和量化。

细胞拉伸实验

过表达PKD2的HCC细胞被接种在涂有COL1的聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面上。在细胞拉伸之前，根据制造商的说明使用钙荧光探针Fluo-4（Beyotime Biotechnology）对钙离子进行染色。使用Cell Sealing Culture System（CELLTANK）将PDMS上的细胞拉伸至20%的变形程度，持续1分钟，然后用荧光显微镜（Olympus，日本）随机拍摄五个视野。细胞的MFI使用ImageJ版本1.8.0进行分析。

彗星实验

HCC细胞（1 × 10^5）接受奥沙利铂处理48小时（MHCC97H细胞用30微摩尔/升，Hep3B细胞用20微摩尔/升）。处理后，细胞被收集并重新悬浮在150微升的1× PBS中。然后根据制造商的说明使用Trevigen Comet Assay Kit（Beyotime Biotechnology；产品编号#C2041M）进行三次中性彗星实验。它们的荧光图像是使用奥林巴斯荧光显微镜（Olympus）获取的。测量每个切片上至少30个细胞的荧光信号，并使用Comet Assay Software Project（Beijing Bio-launching Technology Co., Ltd.）计算平均尾部矩（TM）以确定DNA损伤程度。

共免疫沉淀和免疫沉淀

HCC细胞的核蛋白和总蛋白是用指定的捕获抗体进行免疫沉淀的。提取的核蛋白或总蛋白（400微克）在4°C下与捕获抗体[PP2RCA（ABclonal，产品编号#A6702，RRID:AB_2767286，1:100）、Flag（Proteintech，产品编号#66008-4-Ig，RRID:AB_2918475，1:100）、MRE11（Abcam，产品编号#ab214，RRID:AB_302859，1:100）或对照IgG（Cell Signaling Technology，产品编号#2729，RRID:AB_1031062，1:100）共孵育过夜。随后加入30微升的protein A/G混合磁珠（Millipore，产品编号#618989），混合物在室温下继续旋转孵育30分钟。与抗原-抗体复合物结合的磁珠使用磁分离器（Invitrogen）沉淀。用1× PBS洗涤三次后，混合物在含有二硫苏糖醇的1× SDS加载缓冲液中变性并煮沸10分钟（95°C）。上清液中的捕获蛋白通过Western blot进行分析。

PP2A酶活性

每组收集5 × 10^7个细胞并进行裂解。使用BCA检测试剂盒（Beyotime Biotechnology，产品编号#P0012）测定蛋白浓度。PP2A酶活性根据Serine/Threonine Phosphatase Assay System试剂盒（Promega，产品编号#V2460）的手册进行测定。

分子对接分析

蛋白质序列和基本信息是从UniProt数据库中检索的。选择了两种人类蛋白质MRE11（UniProt ID: P49959）和BANF1（UniProt ID: O75531）进行分析，它们的晶体结构（PDB ID: MRE11为3TLI，BANF1为7Z21）用于后续建模。使用OPLS_4力场对两种蛋白质进行结构能量最小化。蛋白质-蛋白质对接模拟使用嵌入在Schrodinger平台中的Piper算法模块进行。生成了1,000个初始旋转构象，并根据原子坐标的均方根偏差对这些构象进行聚类。每个簇中，邻居密度最高的构象被定义为代表性结构。所有聚类的构象按簇大小进一步排序，从最大簇中选择的最优构象作为后续功能分析的最佳结合模式。

动物和繁殖

雄性C57BL/6小鼠（RRID: MGI:2159769；4–6周龄）从Weitong Lihua Lab Anim. Cent（Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.）购买。所有小鼠都安置在无特定病原体的实验室中，遵循12/12小时的明暗周期，温度保持在22°C至24°C，湿度为30%至70%，并且可以自由摄取食物和水。饲料为商业饲料（Rat/Mouse Growth & Reprod. Feed，产品编号#P1100；≥20.5%粗蛋白，≥4%粗脂肪；Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.）。

肝 cancer小鼠模型

高肝硬度组和正常肝硬度组的小鼠分别每周两次腹腔注射10%的四氯化碳（橄榄油溶液），持续8周；正常肝硬度组的小鼠则每周两次接受相同量的橄榄油，持续8周。在第56天，将Hepa1-6细胞（1 × 10^6）皮下注射到肝脏胶囊中。植入后三周（第78天），所有小鼠被安乐死并收集其肝脏。测量肿瘤的大小，并使用以下公式计算肿瘤体积（毫米立方）：肿瘤体积 = （长轴）× （短轴）^2 × 1/2。肿瘤的重量使用电子天平测量。动物实验得到了复旦大学中山医院动物护理伦理委员会的批准。

末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记

在石蜡包埋的肿瘤组织切片中，使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记（TUNEL）检测试剂盒（Servicebio，产品编号#G1507）根据制造商的说明检测凋亡细胞。染色切片使用奥林巴斯光学显微镜（Olympus）观察和成像。为了定量分析，每个组织切片捕获五个随机不重叠的视野。通过使用ImageJ软件（版本1.8.0）测量TUNEL阳性细胞的平均光密度来确定HCC组织中的凋亡水平。

HCC患者及其肿瘤组织样本

收集了17名在复旦大学附属中山医院接受TACE后3个月内接受根治性肝切除术的HCC患者的临床数据（2007年4月至2009年11月），并从同医院的病理学部门获取了他们的肿瘤组织样本，并获得了患者的书面知情同意。该研究得到了复旦大学附属中山医院动物护理伦理委员会的批准，符合赫尔辛基宣言和伊斯坦布尔宣言的要求。以肿瘤组织中LOX和COL1A1的中位表达值为临界值，将患者分为两组：COL1A1Low/LOXLow（n = 8，低基质硬度组）和COL1A1High/LOXHigh（n = 9，高基质硬度组）。

统计和可重复性

体外细胞实验至少进行三个生物学重复，并随机将细胞/条件分配到实验组中。体内动物实验每组至少使用六只动物，并在治疗前对小鼠进行随机分配。研究人员在分析前不知道临床信息。定量数据以平均值±标准差表示。统计分析和图表使用GraphPad Prism 9.0.0生成。使用单尾t检验比较两个独立组之间的连续变量。对于具有正态分布和相等方差的数据，使用单向ANOVA进行比较。对于两个独立变量及其交互作用的主要效应，使用双向ANOVA进行评估。分类变量使用Pearson χ2检验进行分析。使用Kaplan–Meier方法绘制存活曲线，并使用log-rank检验评估组间差异。所有统计检验都是双边的，P值<0.05被认为具有统计学意义。

在HCC中筛选和鉴定新型机械传感器

由于细胞膜是细胞与其周围微环境之间的界面，膜上的特定蛋白质可能参与感知和传递细胞外机械信号。毫无疑问，筛选和鉴定膜蛋白中的机械传感器应该是最直接和最有效的策略。基于机械传感器的结构特征（27）以及HCC细胞在机械信号刺激下的表型变化（28），结合单分子机械操作方法（29），我们开发了一种标准程序来筛选和表征HCC细胞膜蛋白中的新型机械传感器（图1A）。我们首先根据之前描述的方案（14）制备了低硬度和高硬度基底（6 kPa和16 kPa），用于培养HCC细胞，并观察到增加的基质硬度显著影响了HCC细胞的形态表型（补充图S1A）。我们之前的研究还表明，增加的基质硬度显著诱导了HCC细胞的上皮-间质转化（14）并增强了它们的运动能力和侵袭伪足形成能力（30）。这些形态变化表明特定的膜蛋白通过直接感知和传递细胞外机械信号参与了基质硬度介导的恶性表型效应。随后，我们分离了在高低硬度基质上生长的HCC细胞的膜蛋白并评估了它们的质量。SDS-PAGE中提取的膜蛋白的蛋白条带分布均匀（补充图S1B）。同时，Na+/K+–ATPase高度表达，但GAPDH几乎检测不到（补充图S1C）。另一方面，我们分析了Piezo1和ITGB1的表达水平，这两种已知的对HCC具有机械敏感性的蛋白（14, 15），以明确膜蛋白表达的硬度依赖性。在高硬度组中，Piezo1和ITGB1的表达水平明显增加（补充图S1D）。这些结果表明，提取的膜蛋白的质量、纯度和硬度依赖性非常适合后续的蛋白质组学筛选分析。

图1. HCC中新型机械传感器的筛选和鉴定。A. HCC膜蛋白中新机械传感器的筛选和鉴定示意图。B. 对硬度依赖性膜蛋白的四维无标记蛋白质组学分析。C. 候选差异膜蛋白的热图。D和E. 在低硬度与高硬度基底上培养的HCC细胞的膜组分和总蛋白裂解物中的SDC4和PKD2表达（n = 3）。P，非配对t检验。F，3D水凝胶培养系统的示意图。G，第1天和第14天在低硬度和高硬度水凝胶中的细胞聚集。刻度尺，50 μm。H，低硬度与高硬度水凝胶中SDC4和PKD2的表达（n = 3）。P，非配对t检验。I，磁镊系统。J和K，在不同机械力作用下HCC细胞中的p-FAK和p-YAP比率（n = 3）。P，双因素方差分析。L，细胞拉伸实验的工作流程。M，机械拉伸前后HCC细胞内的Ca2+水平（n = 5）。刻度尺，50 μm。P，双因素方差分析。ns，P > 0.05；*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。A，用BioRender创建。Li, J. (2026) https://BioRender.com/enyrrzr；F，用BioRender创建。Li, J. (2026) https://BioRender.com/o1bmo42；I，用BioRender创建。Li, J. (2026) https://BioRender.com/i8l52du；L，用BioRender创建。Li, J. (2026) https://BioRender.com/z60z48e。

图1。查看大图/下载幻灯片

在HCC中筛选和鉴定新的机械传感器。A，筛选和鉴定HCC膜蛋白中新型机械传感器的示意图。B，对硬度依赖性膜蛋白进行四维无标记蛋白质组学分析。C，候选差异膜蛋白的热图。D和E，在低硬度与高硬度基底上HCC细胞膜组分和总蛋白裂解物中的SDC4和PKD2表达（n = 3）。P，非配对t检验。F，3D水凝胶培养系统的示意图。G，第1天和第14天在低硬度和高硬度水凝胶中的细胞聚集。刻度尺，50 μm。H，低硬度与高硬度水凝胶中SDC4和PKD2的表达（n = 3）。P，非配对t检验。I，磁镊系统。J和K，在不同机械力作用下HCC细胞中的p-FAK和p-YAP比率（n = 3）。P，双因素方差分析。L，细胞拉伸实验的工作流程。M，机械拉伸前后HCC细胞内的Ca2+水平（n = 5）。刻度尺，50 μm。P，双因素方差分析。ns，P > 0.05；*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。A，用BioRender创建。Li, J. (2026) https://BioRender.com/enyrrzr；F，用BioRender创建。Li, J. (2026) https://BioRender.com/o1bmo42；I，用BioRender创建。Li, J. (2026) https://BioRender.com/i8l52du；L，用BioRender创建。Li, J. (2026) https://BioRender.com/z60z48e。关闭图1。

通过应用四维无标记定量蛋白质组学技术，我们继续在高硬度和低硬度组之间筛选硬度依赖性的差异膜蛋白。考虑到ITGB1作为机械传感器已在HCC中被认可（14），我们将ITGB1的倍数变化（>1.46或<0.68）和统计显著性（P < 0.05）定为阈值，以确定硬度依赖性的差异膜蛋白。同时，使用CE洛网站（http://cello.life.nctu.edu.tw/）进一步排除了鉴定出的非膜蛋白。我们共鉴定出445种硬度依赖性的差异膜蛋白，包括高硬度组中的426种上调膜蛋白和19种下调膜蛋白（图1B；补充图S1E）。目前已知的机械传感器主要分为离子通道蛋白和受体/粘附分子蛋白（31）。钙通道蛋白是最主要的离子通道蛋白类型（32）。受体/粘附分子蛋白大多是跨膜蛋白，它们的细胞外结构域经常与细胞外基质（ECM）蛋白相连（33）。因此，在上调的膜蛋白中，我们主要关注上述两种类型的蛋白。我们使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）基因集（hsa04512: ECM–受体相互作用）作为筛选基因集来确定候选的粘附分子/受体蛋白。另一方面，我们结合相关文献综述（34–39）使用UniProt（https://www.uniprot.org）形成了一个钙离子通道基因集（补充表S4）来确定候选的钙离子通道蛋白。最终获得了9种候选的差异膜蛋白，包括5种钙通道蛋白和4种受体/粘附分子（图1C；补充图S1F；补充表S5）。在四种受体/粘附分子蛋白中，syndecan-4（SDC4）被选为感兴趣的目标蛋白。同样，在5种差异钙通道蛋白中，polycystin-2（PKD2）被确定为感兴趣的目标蛋白。SDC4和PKD2的跨膜区域（https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）和质谱的特征指纹图谱分别在补充图S1G和S1H中展示。随后，我们确认了在高硬度组中SDC4和PKD2在膜蛋白和总蛋白中的高表达（图1D和E），这支持了PKD2和SDC4的表达变化是依赖于硬度的。为了进一步验证这一发现，我们混合了RGD修饰的海藻酸盐和CaCl2来开发3D水凝胶培养系统（图1F）。水凝胶表面和内部部分的杨氏模量没有显著差异（补充图S1I）。含有25 mmol/L Ca2+的水凝胶和含有45 mmol/L Ca2+的水凝胶的杨氏模量分别接近6 kPa和16 kPa（补充图S1I），这与正常肝组织和肝硬化肝组织的硬度相匹配。同时，高硬度与低硬度水凝胶之间的渗透性和孔径均匀性几乎相同（补充图S1J和S1K）。这些数据表明所建立的水凝胶可以用来探索基质硬度介导的效应。我们检查了水凝胶中细胞聚集的组织特征，发现与低硬度水凝胶中的聚集相比，高硬度水凝胶中的ICAM1、ITGB1和paxillin的表达都增加了（补充图S1L和S1M）。此外，Ki67、MMP2和核YAP的表达也升高了。这些结果支持高硬度水凝胶中的细胞聚集表现出组织特征和恶性特征，表明它们更好地模拟了具有正常和高肝硬度背景的HCC组织。另外，高硬度水凝胶中的细胞聚集大小明显大于低硬度水凝胶中的聚集大小（图1G），这表明基质硬度对细胞增殖有促进作用。高硬度水凝胶中细胞聚集中的Ki67高表达（补充图S1L和S1M）也支持了这一结果。更重要的是，高硬度水凝胶中SDC4和PKD2的表达水平显著高于低硬度水凝胶中的表达水平（图1H），这与上述发现一致。这些证据证实高硬度刺激确实增加了HCC细胞中PKD2和SDC4的表达水平。为了阐明PKD2和SDC4在机械信号传递中的桥梁作用，我们进一步评估了SDC4过表达/敲低或PKD2过表达/敲低（补充图S1N和S1O）对HCC细胞下游经典硬度响应分子的影响。结果表明，SDC4或PKD2的表达水平与p-FAK的比率呈正相关，但与p-YAP的比率呈负相关（补充图S1P–S1S），表明PKD2和SDC4可以传递硬度机械信号来激活HCC细胞中的下游硬度响应分子。之后，我们构建了一个简单的磁镊实验系统来直接验证SDC4在机械信号传递中的桥梁作用。实验程序和设备的示意图分别显示在图1I和补充图S1T中。使用Maxwell模拟软件，我们明确了设备表面中心点Z轴正方向上的磁场强度与距离之间的关系（补充图S1U）。根据磁力计算公式（21），我们确定了高磁力组（约12 pN）和低磁力组（约6 pN）的磁力值。同时，我们准备了涂有SCD4抗体的磁珠，并与HCC细胞共培养在培养皿中。然后对与磁珠结合的HCC细胞施加磁力30分钟。我们检查了下游经典硬度响应分子的表达变化，发现与非特异性磁力组相比，SCD4特异性磁力组中p-FAK的比率显著增加，而p-YAP的比率降低。此外，随着磁力的增加，p-FAK的比率显著升高，p-YAP的比率明显降低（图1J和K）。这些数据强烈表明SDC4可以直接响应机械信号并改变下游细胞功能。细胞内钙离子含量的变化可以间接反映PKD2的活性。我们在低硬度基底上培养了过表达PKD2的HCC细胞，并研究了PKD2表达与其活性之间的关系。我们观察到细胞内钙离子含量增加（补充图S1V），但PKD2抑制剂amiloride有效地减弱了这一效应（补充图S1W），表明PKD2表达与其功能活性之间存在正相关。我们使用在高硬度和低硬度基底上的HCC细胞来测试PKD2是否能感知机械信号刺激。结果显示，高硬度组中的细胞内钙离子含量显著高于低硬度组（补充图S1X）。上述数据间接表明PKD2可能作为机械信号传感器来感知机械信号刺激。使用细胞拉伸设备，我们进一步确认了PKD2在感知机械信号中的作用。细胞拉伸实验的工作流程以及拉伸距离和时间曲线分别显示在图1L和补充图S1Y中。我们比较分析了机械拉伸前后HCC细胞内的钙离子含量，发现PKD2过表达的HCC细胞在拉伸后的细胞内Ca2+含量显著增加。同时，PKD2抑制剂amiloride有效地逆转了这一效应（图1M）。综合这些发现，结合补充图S1V–S1X的结果，证实PKD2可以感知机械信号，从而增加HCC细胞中的Ca2+流入。

在我们初步的研究中，我们观察到一种现象：增加的基质硬度会减弱奥沙利铂诱导的HCC细胞凋亡效果（40）。为了进一步确认基质硬度对细胞毒性药物反应的影响，我们将奥沙利铂应用于在高硬度和低硬度基底上生长的HCC细胞48小时，发现高硬度组中的凋亡细胞数量以及切割的caspase 3和γ-H2AX的比率都显著低于低硬度组（图2A和B）。同样，彗星试验的分析也显示，高硬度组中HCC细胞的尾部长度（TM）明显短于低硬度组（图2C）。为了明确增加的基质硬度是通过DNA修复（DDR）而不是缺陷的DNA损伤感知导致奥沙利铂耐药性的，我们对在高硬度和低硬度基底上生长的奥沙利铂处理过的HCC细胞进行了γH2AX和额外激活的DDR标志物（p-ATM和p-CHK2）的时间过程分析。在最初的12小时内，高硬度组和低硬度组之间的p-ATM和p-CHK2比率以及γ-H2AX表达没有显著差异。然而，随着时间的推移，高硬度组中的γ-H2AX水平下降更快，而p-ATM和p-CHK2比率呈现上升趋势（补充图S2A）。IF染色中γ-H2AX表达的时间过程分析（补充图S2B）也显示了同样的趋势。总体而言，基质硬度确实通过改善DDR增加了HCC细胞对奥沙利铂的耐药性。

图2。查看大图/下载幻灯片

增加的基质硬度促进了HCC细胞中的DNA修复（DDR）。A，在低硬度与高硬度基底上处理48小时的奥沙利铂处理后的HCC细胞凋亡（n = 3）。P，非配对t检验。B和C，在低硬度与高硬度基底上处理48小时的奥沙利铂处理后的HCC细胞中切割的caspase 3和γ-H2AX比率（n = 3）以及核DNA尾部长度（n = 30）。刻度尺，50 μm。P，非配对t检验。D，用于评估奥沙利铂反应的高硬度和正常肝硬度HCC小鼠模型的示意图。E，高硬度和正常肝硬度HCC小鼠模型中奥沙利铂处理后的肿瘤外观。F，苏木精和伊红（H&E）染色显示的HCC肿瘤细胞形态。刻度尺，100 μm。G，高硬度与正常硬度组中奥沙利铂处理后的肝脏肿瘤体积和重量（n = 6）。P，非配对t检验。H–J，奥沙利铂处理后肿瘤组织中凋亡细胞的TUNEL染色以及SDC4和PKD2的表达水平，在正常和高肝硬度背景下（n = 6）。刻度尺，50 μm。P，非配对t检验。*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001。D，在BioRender中创建。Li, J. (2026) https://BioRender.com/72rh15c。图2。放大查看下载幻灯片。增加的基质硬度促进了HCC细胞中的DNA修复（DDR）。A，在低硬度和高硬度基质上处理48小时的含奥沙利铂的HCC细胞中的凋亡（n = 3）。P，非配对t检验。B和C，切割的caspase 3和γ-H2AX比率（n = 3）以及在低硬度和高硬度基质上处理48小时的含奥沙利铂的HCC细胞中的核DNA碎片化（n = 30）。刻度尺，50 μm。P，非配对t检验。D，用于评估奥沙利铂反应的高硬度与正常硬度肝HCC小鼠模型的示意图。E，在高硬度与正常硬度肝HCC小鼠模型中奥沙利铂处理后的肿瘤外观。F，苏木精和伊红（H&E）染色显示HCC肿瘤细胞形态。刻度尺，100 μm。G，在高硬度与正常硬度组中奥沙利铂处理后的肝肿瘤体积和重量（n = 6）。P，非配对t检验。H–J，在正常硬度和高硬度背景下奥沙利铂处理后肿瘤组织中凋亡细胞的TUNEL染色以及SDC4和PKD2的表达水平（n = 6）。刻度尺，50 μm。P，非配对t检验。*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001。D，在BioRender中创建。Li, J. (2026) https://BioRender.com/72rh15c。关闭图2。通过联合建模方法（图2D），我们开发了具有高硬度与正常硬度背景的肝癌小鼠模型，以进一步评估体内奥沙利铂的药物反应。在模型建立的第52天，从高硬度组和正常硬度组中随机处死六只小鼠，并收集它们的肝组织进行肝硬度评估。高硬度组的肝表面明显比对照组更粗糙（补充图S2C）。对Sirius red染色、网状纤维染色和Masson三色染色的分析显示，高硬度组的阳性区域明显大于对照组（补充图S2D），表明形成了具有高肝硬度的小鼠模型。在第56天，将Hepa1-6细胞原位植入高硬度或正常硬度模型的小鼠肝脏中。在第66天，每3天给小鼠腹腔注射5 mg/kg奥沙利铂。所有小鼠在第78天被处死，并收集肿瘤组织（图2E）。苏木精和伊红染色显示典型的肿瘤细胞形态（图2F）。高硬度背景组的肝肿瘤体积和重量明显大于对照组（图2G）。TUNEL染色分析显示，高硬度背景下的HCC细胞中的凋亡水平显著低于对照组（图2H）。所有这些发现表明，高硬度背景下的肝肿瘤对奥沙利铂表现出明显的抗性。此外，两个机械传感器SDC4和PKD2在高硬度背景下的表达水平显著升高（图2I和J），这与体外细胞实验的结果一致。SDC4和PKD2共同参与了HCC细胞中由基质硬度促进的DNA修复。

在低硬度基质上培养过表达SDC4的HCC细胞，并用奥沙利铂处理48小时。SDC4过表达显著降低了切割的caspase 3/caspase 3比率、γ-H2AX表达、彗星试验碎片化（TM）和凋亡细胞数量（图3A和B；补充图S3A，S3B），表明SDC4过表达增强了低硬度培养中奥沙利铂诱导的DNA修复。相反，在高硬度培养中SDC4敲低产生了相反的效果（图3C和D；补充图S3C和S3D），抑制了DNA修复。在过表达或敲低PKD2的HCC细胞中进行的平行实验也得到了类似的结果。在低硬度培养中PKD2过表达再现了HCC的DNA修复表型（图3E和F；补充图S3E和S3F），而在高硬度培养中PKD2敲低则逆转了这些表型（图3G和H；补充图S3G和S3H）。总体而言，这些数据表明SDC4和PKD2可以在HCC细胞中共同介导由基质硬度促进的DNA修复。

我们进一步阐明了SDC4和PKD2在介导由基质硬度促进的DNA修复中的协作作用。与单独敲低SDC4或单独使用氨氯地平相比，同时敲低SDC4和氨氯地平显著提高了在高硬度基质上生长的HCC细胞中的切割caspase 3/caspase 3比率和γ-H2AX表达，并延长了HCC细胞的DNA碎片化时间（图3I和图3J；补充图S3I）。同样，与单独下调相比，同时下调SDC4和PKD2也显著提高了切割caspase 3比率、γ-H2AX表达（图3K）、彗星试验碎片化（图3L；补充图S3J）和凋亡细胞比例（补充图S3K）。这些结果表明，SDC4和PKD2可以在HCC细胞中共同介导DNA修复。这些发现通过使用高硬度小鼠原位植入稳定表达shSDC4#3、shPKD2#2或shSDC4 + shPKD2的Hepa1-6细胞得到验证（基于敲低效率选择；补充图S3L）。植入后十天，小鼠每3天腹腔注射5 mg/kg奥沙利铂，持续9天，然后收集它们的肿瘤组织（补充图S3M）。SDC4或PKD2敲低显著减少了肿瘤重量和体积，同时增加了肿瘤内的凋亡（图3M和图N）。值得注意的是，同时敲低SDC4/PKD2产生了最显著的抗肿瘤效果和最高的凋亡率（图3M和图N）。这些体内数据证实了体外实验的结果，也支持SDC4和PKD2共同介导由基质硬度促进的DNA修复。SDC4和PKD2还共同介导了由基质硬度增加的BANF1核转位。在经过奥沙利铂治疗后，肝硬度较高的SDC4-、PKD2-或SDC4/PKD2下调的HCC小鼠模型中，BANF1在肿瘤组织中的核定位（n = 6）。刻度线，50 μm。P，双向方差分析（two-way ANOVA）。ns，P > 0.05；*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。参见图4。通过对比差异核蛋白与先前报道的DDR蛋白（41），确定BANF1是可能参与DDR的靶核蛋白。为了验证基质硬度对BANF1表达定位的影响，我们检测了在高硬度及低硬度基质上生长的奥沙利铂处理过的HCC细胞中BANF1的总蛋白和核蛋白表达水平。结果显示，高硬度组中的BANF1核蛋白水平明显升高（图4C）。然而，高硬度组和低硬度组之间的BANF1总蛋白水平没有显著差异（图4D）。此外，我们还分析了具有正常和肝硬度背景的HCC小鼠模型肿瘤组织切片中BANF1的表达定位。在高肝硬度背景的HCC细胞中，BANF1的核转运显著增加（图4E）。基质硬度增强了BANF1的核转运，但未改变其总表达量。接下来，我们研究了SDC4和PKD2是否介导这一过程。SDC4过表达增加了核BANF1的水平（图4F），而SDC4敲低则降低了其水平（图4G），同时总BANF1水平没有变化（补充图S4C和S4D）。相应地，PKD2过表达（图4H）和PKD2敲低也对核BANF1水平产生了类似的影响，且未影响其总表达（图4I；补充图S4E和S4F）。SDC4敲低与PKD2抑制剂（阿米洛利）联合使用，在高硬度培养条件下比单独使用任何一种抑制剂时更显著地减少了BANF1的核转运（图4J）。同样地，SDC4和PKD2联合敲低产生了最强的抑制效果（图4K）。在高肝硬度背景的HCC小鼠模型肿瘤组织切片中，SDC4或PKD2敲低均减少了肿瘤内的BANF1核转运，其中联合敲低组的效果最显著（图4L），这与体外研究结果一致。总体而言，SDC4和PKD2共同介导了基质硬度诱导的HCC中BANF1的核转运。SDC4和PKD2还通过PP2A酶的组装和活性以及DDR共同调节HCC细胞中的BANF1去磷酸化。

BANF1的磷酸化决定了其亚细胞定位（42）。为了阐明BANF1磷酸化对其核转运的抑制作用，我们将对照质粒、WT-BANF1质粒、MAAAAQ和MDDDQ转染到HCC细胞中以分析它们的BANF1核表达情况。WT-BANF1细胞中的核BANF1水平显著高于对照组。与WT-BANF1相比，MAAAAQ组中的核BANF1水平显著增加，而MDDDQ组中的核BANF1水平则降低（图5A）。这些数据表明BANF1的去磷酸化促进了其核转运。我们进一步探讨了SDC4和PKD2如何导致BANF1去磷酸化。免疫沉淀（IP）实验显示，SDC4或PKD2的敲低明显增加了HCC细胞中的BANF1磷酸化水平（图5B和C），表明SDC4或PKD2在BANF1磷酸化中起调节作用。有研究表明，BANF1可以被PP2A去磷酸化（43），PP2A是一个由支架亚单位（PP2A-A）、调节亚单位（PP2A-B）和催化亚单位（PP2A-C）组成的异三聚体复合体（参考文献44）。因此，PP2A-C在调节BANF1磷酸化中起关键作用（45）。共免疫沉淀实验确认了BANF1与PP2A-C之间的相互作用（图5D）。此外，LB-100（PP2A抑制剂）的干预显著降低了BANF1的核蛋白水平（补充图S5A）。另外，LB-100还降低了p-ATM和p-CHK2的比例，并增加了γ-H2AX的水平。这些结果表明PP2A通过BANF1的去磷酸化影响DDR（补充图S5B）。现有研究表明，整合素有助于PP2A全酶的组装（46），细胞骨架重塑也是影响PP2A组装的关键因素之一（47）。SDC4在结构和功能上类似于整合素；其细胞外结构域与基质蛋白相互作用，并影响细胞骨架重塑（48）。此外，PP2A的酶活性通过Ca2+与PP2A-B中的PR130亚单位的EF-hand结构域结合而被激活（49）。基于以上证据，我们推测SDC4和PKD2可能共同影响PP2A的组装和活性，从而去磷酸化BANF1。PKD2过表达显著增强了HCC细胞中的PP2A活性，而阿米洛利显著抑制了这一活性（图5E）。结合补充图S1W中的数据，我们得出结论，PKD2介导的Ca2+流入增加了PP2A活性。此外，SDC4过表达增强了PP2A-C与PP2A-A和PP2A-PR130之间的相互作用（图5F），而SDC4敲低减少了这种作用（补充图S5C），表明SDC4促进了PP2A全酶的组装。总的来说，SDC4促进PP2A的组装，而PKD2增强了PP2A的活性。它们共同增强了BANF1的去磷酸化，并增加了其核转运。图5。

我们进一步观察到BANF1核转运对DDR的影响，发现WT-BANF1质粒组和MAAAAQ质粒组的HCC细胞表现出较低的γ-H2AX表达和较短的DNA修复时间（TM）（图5G和H）。相反，MDDDQ质粒组的HCC细胞表现出较高的γ-H2AX表达和较长的DNA修复时间（TM）（图5G和H）。因此，BANF1的核转运显著增强了DDR。BANF1通过调节MRE11–RAD50–NBS1复合物的形成来增强HCC细胞中的DDR。

我们继续探讨BANF1核转运如何调节DDR。免疫荧光（IF）显示，在奥沙利铂处理后24小时和48小时，BANF1和γ-H2AX在细胞核中显著共定位（图6A；补充图S6A），表明BANF1在DNA双链断裂（DSB）位点聚集。此外，我们比较了奥沙利铂处理后24小时和48小时BANF1、p-ATM、p-CHK2和γ-H2AX在核蛋白中的水平变化，结果显示核BANF1和修复标志物（p-ATM、p-CHK2）的表达逐渐增加，但在DNA损伤早期阶段γ-H2AX的比例增加，随后减少（补充图S6B），支持BANF1核转运增强DDR的发现。随后，我们使用免疫沉淀结合串联质谱（IP-MS/MS）技术筛选了携带Flag-BANF1的HCC细胞核蛋白中BANF1的相互作用蛋白。通过Coomassie Brilliant Blue染色评估了IP蛋白的质量（补充图S6C）。设定肽计数阈值>2和IP/IgG倍数变化>2（或IgG = 0），鉴定出90个候选相互作用蛋白。通过与已报道的DDR基因集（50）的对比分析，发现唯一的共同蛋白MRE11是BANF1的结合靶蛋白（图6B）。接下来，我们使用共免疫沉淀实验（图6C）和免疫荧光染色（图6D）确认了BANF1与MRE11之间的结合相互作用。所有结果都支持它们之间的结合相互作用。在DDR过程中，MRE11–RAD50–NBS1（MRN）复合物由MRE11、RAD50和NBS1组成，可迅速形成并定位于DSB位点。该复合物激活ATM激酶，启动DNA修复过程（51）。我们推测BANF1的核转运可能通过调节MRN复合物的形成来促进DDR。IP实验显示，BANF1过表达显著增强了MRE11与RAD50和NBS1的相互作用（图6E），表明BANF1的核转运可能有助于MRN复合物的组装。图6。

BANF1核转运在HCC细胞中增强DDR。A，在转染了对照质粒、WT-BANF1、MAAAAQ或MDDDQ的HCC细胞中，对BANF1的核蛋白水平进行了比较分析（n = 3）。P，双向方差分析（two-way ANOVA）。B和C，在SDC4或PKD2敲低的HCC细胞中进行BANF1磷酸化的免疫沉淀实验（IP assay）。D，共免疫沉淀实验检测BANF1与PP2A-C在HCC细胞中的相互作用（Co-IP assay）。E，在有或没有阿米洛利干预的情况下，测量了PKD2过表达的HCC细胞中的PP2A活性（PP2A activity）。P，单向方差分析（one-way ANOVA）。F，在SDC4过表达的HCC细胞中，检测PP2A-C、PP2A-A和PP2A-PR130之间的相互作用（IP analysis）。G，在转染了对照质粒、WT-BANF1、MAAAAQ和MDDDQ的奥沙利铂处理过的HCC细胞中，γ-H2AX的表达情况（n = 3）。P，双向方差分析（two-way ANOVA）。H，在转染了对照质粒、WT-BANF1、MAAAAQ和MDDDQ的奥沙利铂处理过的HCC细胞中，48小时后的核DNA拓扑结构（n = 30）。刻度线：50 μm。P，双向方差分析（two-way ANOVA）。*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。参见图5。

我们进一步观察了BANF1核转运对DDR的影响，发现WT-BANF1质粒组和MAAAAQ质粒组的HCC细胞显示γ-H2AX表达较低且DNA修复时间较短（图5G和H）。相反，MDDDQ质粒组的HCC细胞表现出较高的γ-H2AX表达和较长的DNA修复时间（图5G和H）。因此，BANF1的核转运显著增强了DDR。BANF1通过调节MRE11–RAD50–NBS1复合物的形成来增强HCC细胞中的DDR。

我们继续研究BANF1核转运如何调节DDR。免疫荧光（IF）显示，在奥沙利铂处理后24小时和48小时，BANF1和γ-H2AX在细胞核中明显共定位（图6A；补充图S6A），表明BANF1在DNA DSB位点富集。此外，我们比较了奥沙利铂处理后24小时和48小时BANF1、p-ATM、p-CHK2和γ-H2AX在核蛋白中的水平变化，结果表明核BANF1和修复标志物（p-ATM、p-CHK2）的表达逐渐增加，但在DNA损伤早期阶段γ-H2AX的比例增加，之后减少（补充图S6B），这支持了BANF1核转运增强DDR的发现。随后，我们应用免疫沉淀结合串联质谱（IP-MS/MS）技术筛选携带Flag-BANF1的HCC细胞核蛋白中BANF1的相互作用蛋白。通过Coomassie Brilliant Blue染色评估了IP蛋白的质量（补充图S6C）。设定肽计数阈值>2和IP/IgG倍数变化>2（或IgG = 0），鉴定出90个候选相互作用蛋白。通过与已报道的DDR基因集（50）的对比分析，唯一共同的蛋白质是MRE11，它被确定为与BANF1结合的靶蛋白（图6B）。接下来，我们使用共免疫沉淀实验（图6C）和免疫荧光染色（图6D）确认了BANF1与MRE11之间的结合相互作用。所有结果都支持它们之间的结合相互作用。在DDR过程中，MRE11–RAD50–NBS1（MRN）复合物由MRE11、RAD50和NBS1组成，可以迅速形成并定位于DSB位点。该复合物激活ATM激酶，启动DNA修复过程（51）。我们推测BANF1的核转运可能通过调节MRN复合物的形成来促进DDR。IP实验显示，BANF1过表达显著增强了MRE11与RAD50和NBS1的相互作用（图6E），表明BANF1的核转运可能有助于MRN复合物的组装。图6。

BANF1核转运在HCC细胞中增强DDR。A，在奥沙利铂处理后48小时，HCC细胞核中BANF1与γ-H2AX的共定位分析。蓝色，DAPI；绿色，γ-H2AX；红色，BANF1。刻度线，5 μm。B，通过对比已鉴定的与BANF1结合的蛋白质和已报道的DDR基因，确认了它们之间的结合相互作用（An intersection analysis between the identified binding proteins with BANF1 and the reported DDR genes）。C，在奥沙利铂处理后48小时，HCC细胞核中BANF1与MRE11之间的共免疫沉淀实验（Co-IP assays）确认了它们之间的结合相互作用（Co-IP assays confirmed that there was a binding interaction between BANF1 and MRE11 in the nucleus of HCC cells after 48 hours of oxaliplatin treatment）。D，在奥沙利铂处理的HCC细胞中，MRE11与BANF1的共定位分析（A co-localization analysis between MRE11 and BANF1）。蓝色，DAPI；绿色，MRE11；红色：BANF1。刻度线，10 μm。E，在BANF1过表达的HCC细胞中，检测MRN相互作用的免疫沉淀实验（IP assay）。F，使用Schrodinger软件预测MRE11与BANF1之间的潜在结合位点（Prediction of the potential binding sites between MRE11 and BANF1）。黄色，BANF1；青色，MRE11。G，BANF1位点突变对奥沙利铂处理的HCC细胞核蛋白中BANF1与MRE11相互作用的影响（The effects of BANF1 site mutation on the interaction between BANF1 and MRE11）。H，BANF1位点突变对奥沙利铂处理的HCC细胞核蛋白中MRE11与RAD50和NBS1结合的影响（The effects of BANF1 site mutation on the binding of MRE11 with RAD50 and NBS1）。I–K，BANF1位点突变对p-ATM和γ-H2AX比例的影响（n = 3），核DNA拓扑结构（n = 30），以及γ-H2AX阳性细胞（n = 5）（The effects of BANF1 site mutation on the p-ATM and γ-H2AX ratios）。蓝色，DAPI；绿色，γ-H2AX。刻度线，50 μm。P，双向方差分析（two-way ANOVA）。**，P < 0.01；***，P < 0.001。参见图6。利用Schr?dinger软件，我们获得了MRE11–BANF1的结合界面，包括BANF1的Thr3与MRE11的Phe398、BANF1的Glu83与MRE11的Leu274、BANF1的Asp86与MRE11的His63以及BANF1的Lys54与MRE11的Glu64（见图6F；补充表S7）。分子动力学模拟显示，这些结合能量的分别为?54.2（T3A）、?51.5（E83A）、?45.3（D86A）和?56.2 kcal·mol?1（K54A）（补充表S8）。为了研究核内BANF1在信使RNA（MRN）组装中的作用，我们生成了BANF1的突变体（T3A/K54A/E83A/D86A、E83A/D86A）。与对照载体相比，WT-BANF1增强了核内BANF1与MRE11的相互作用（见图6G），而T3A/K54A/E83A/D86A和E83A/D86A突变体则显著削弱了这种结合。WT-BANF1还促进了MRN复合物的形成，而突变体则抑制了这一过程（见图6H）。因此，核内BANF1与MRE11的结合有助于HCC细胞中的MRN组装和DNA损伤修复（DDR），其中Thr3、Lys54、Glu83和Asp86是关键的界面残基。为了验证核内BANF1在DDR中的调节作用，我们将对照质粒、WT-BANF1、T3A/K54A/E83A/D86A或E83A/D86A质粒分别转染到HCC细胞中，以检测MRN下游效应因子（p-ATM、p-CHK2、γ-H2AX）的变化。WT-BANF1提高了p-ATM和p-CHK2的水平，而两种突变体则产生了相反的效果（见图6I；补充图S6D）。彗星实验和免疫荧光（IF）染色结果表明，WT-BANF1降低了彗星尾长和γ-H2AX阳性的细胞比例，而突变体则增加了这些指标（见图6J和K）。由此可见，核内BANF1通过调节MRN复合物的形成，有效增强了HCC细胞中的DDR。

临床数据收集了17名HCC患者的肿瘤组织，这些患者在接受奥沙利铂（TACE）治疗后3个月内进行了肿瘤根治性切除。由于组织硬度的增加主要归因于细胞外基质（ECM）蛋白质的过度沉积和交联（52），因此可以通过COL1A1和LOX的表达来指示组织硬度。根据它们的中位表达水平，患者被分为低硬度组（COL1A1Low/LOXLow，n = 8）和高硬度组（COL1A1High/LOXHigh，n = 9）（见图7A）。高组织硬度与TACE治疗后肿瘤缩小的程度降低有关（见图7B），这与我们的动物实验结果一致。高硬度组患者的总生存期和无病生存期也显著缩短（见图7C），凋亡指数也较低（见图7D），这表明组织硬度会增加奥沙利铂的化疗耐药性。因此，组织硬度的降低会使得HCC患者的预后较差。此外，SDC4和PKD2在奥沙利铂治疗后HCC组织中的表达及BANF1的核定位也得到了验证。

此外，我们还验证了奥沙利铂治疗后HCC组织中SDC4和PKD2的表达以及BANF1的核定位。A项结果显示，在奥沙利铂治疗后，通过对HCC组织进行连续石蜡切片分析，观察到LOX和COL1A1的表达变化（COL1A1Low/LOXLow = 8；COL1A1High/LOXHigh = 9，n = 9，比例尺为100 μm）。B项数据显示，低硬度组和高硬度组患者在奥沙利铂治疗前后的肿瘤大小有明显差异（P值通过配对t检验进行统计）。C项采用Kaplan–Meier分析比较了两组患者的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）曲线（P值通过Log-rank检验进行统计）。D-F项通过TUNEL染色和Western blot检测了高硬度组和低硬度组中的凋亡细胞以及SDC4和PKD2的表达水平（比例尺为50 μm，P值通过配对t检验进行统计）。G项分析了高硬度组和低硬度组之间SDC4和PKD2表达的关系。H项显示了BANF1在两组组织中的核定位情况（比例尺为50 μm，P值通过配对t检验进行统计，*表示P < 0.05；****表示P < 0.0001）。数据进一步表明，SDC4和高硬度组中PKD2的表达水平存在显著差异。AOD表示平均光学密度，DFS表示无病生存期。图7显示，在高硬度组中，SDC4和PKD2的表达显著升高，同时BANF1的核定位也显著增强。

临床挑战之一是细胞毒性药物的耐药性问题仍未得到有效解决。因此，从其他新的角度探索DNA损伤修复（DDR）的机制具有重要意义。尽管组织硬度的增加可能对DDR有促进作用（53），但其潜在机制仍大多不明确。整合素β1/α5和Piezo1作为HCC的机械传感器，已被证实可以介导由组织硬度引起的上皮间质转化（EMT）和血管生成（14, 15）。然而，除了这两种机械传感器外，关于HCC中是否存在其他新的机械传感器知之甚少。基于机械传感器的结构和功能特点及其在HCC中的相关研究进展，结合多尺度力学研究的新技术，我们开发了一种筛选和鉴定HCC细胞膜蛋白中新机械传感器的标准方法。我们利用定量蛋白质组学技术比较了高硬度组和低硬度组之间的差异性膜蛋白，然后利用生物信息学工具和文献线索来确定其中的受体/黏附分子膜蛋白和钙通道膜蛋白。在获得的五种钙通道蛋白和四种受体/黏附分子中，SDC4和PKD2被选为感兴趣的目标蛋白。随后，我们在不同硬度的基质和3D水凝胶培养系统中进一步验证了它们的硬度依赖性表达。重要的是，我们进行了多尺度的间接和直接力学实验，以明确PKD2和SDC4在感知机械信号和传递机械信号中的功能，结果表明它们可以作为两种新的HCC机械传感器。我们的数据和其他团队的研究（14, 15, 30, 54）表明，不同类型的细胞可能具有不同的主要机械传感器，同一机械传感器在不同细胞类型中的表达也有所不同。因此，相同的机械传感器在不同细胞类型中可能不会发挥相同的主导作用，主要机械传感器可能因细胞类型的不同而异。其他研究也探讨了SDC4和PKD2的机械转导作用。例如，SDC4在胰腺星形细胞中作为机械传感器（55），PKD2在纤毛中介导机械刺激引起的钙离子内流（56）。然而，SDC4和PKD2在肿瘤细胞中的生物力学转导作用尚未有报道。此外，目前还没有关于SDC4和PKD2在组织硬度促进的DDR中的协同调控作用的报道。因此，SDC4和PKD2可以被视为解释HCC中组织硬度对DDR影响的两类新的机械传感器。SDC4和PKD2这两种功能不同的蛋白质通过不同的途径调节细胞生物学行为/功能：SDC4激活FAK信号通路促进 focal adhesion 形成和细胞骨架重组（57），而PKD2引起钙离子内流，影响肌动蛋白的动态重构（58）。值得注意的是，SDC4-FAK通路和PKD2-钙信号通路共同调节YAP的核转移。具体来说，SDC4通过抑制YAP的磷酸化来促进YAP的核转移；然而，钙信号可能通过激活LATS1/2间接影响YAP的活性（59）。不同通路之间的相互作用表明，在高硬度微环境中，可能存在协同调控机制，影响HCC细胞的增殖、侵袭和耐药性。我们的研究表明，SDC4和PKD2介导的不同机械感知通路在DDR中具有协同效应。我们提供了足够的证据来验证组织硬度的增加显著增强了DDR，并揭示了两种机械感知通路（SDC4和PKD2）在HCC中DNA修复中的新型相互作用。我们的发现支持这样一个观点：在高硬度微环境中，不同机械感知通路之间的相互作用可能是HCC细胞的关键调控机制。我们团队之前描述的ITGB1和Piezo1之间的正反馈环路也支持这一观点（15）。由于DDR发生在细胞核中，我们推测组织硬度的增加可能导致特定蛋白质的核转移，从而改善DDR。通过蛋白质组学方法、CELLO分析和文献线索，我们确定BANF1是可能发生核转移并参与HCC细胞中DDR的目标蛋白。后续实验进一步证实，SDC4和PKD2通过增加PP2A的组装和活性，共同调节了组织硬度增加的BANF1核转移。目前真核细胞中有五种类型的DDR，包括核苷酸切除修复、碱基切除修复、同源重组修复（HRR）和非同源末端连接（NHEJ；参考文献60）。其中，HRR和NHEJ是修复DNA双链断裂（DSB）的主要方法。DNA DSB是奥沙利铂诱导的DNA损伤中最常见的形式（60），HRR被认为是一种高精度的修复方法，而MRN复合物在其中起到关键作用。MRE11作为MRN复合体的核心成分，在DNA DSB的修复中起重要作用（61）。一旦发生DSB，NBS1、MRE11和RAD50会被招募到DSB位点形成MRN复合体（62）。MRE11具有核酸酶活性，处理断裂的DNA末端，从而启动HRR通路（63）。为了阐明核内BANF1对DDR的贡献，我们使用IP-MS/MS和交集分析发现MRE11与核内BANF1相互作用，表明核内BANF1与MRN复合体之间存在潜在联系。通过位点突变实验，我们发现核内BANF1与MRE11的结合显著增强了MRN复合体的组装，并通过增加ATM和CHK2的磷酸化增强了DDR。有研究表明，BANF1的过表达增强了HRR，但抑制了NHEJ，最终抑制了骨肉瘤中的DDR（41）。尽管在HRR中BANF1的促进作用得到了证实，但其结论与我们的发现不同，我们的研究发现支持核内BANF1的进入而非表达水平对DDR的贡献更大。总体而言，在组织硬度促进的DDR中，已经建立了两种不同机械感知通路之间的新型协同调控机制。此外，另一项发现表明，在高硬度基质上培养的正常肝细胞中，SDC4和PKD2的表达也上调，这表明同样的机制也可能在辐射引起的肝损伤中发挥作用，为后续研究提供了新的方向。除了上述调控通路外，还有其他机制途径可以解释组织硬度对药物耐药性的增强作用。一种机制是物理屏障效应，即硬度增加了细胞的聚集，形成物理屏障以保护内部癌细胞免受药物的影响（64）。另一种机制属于生物力学信号通路，即CNN1High癌相关成纤维细胞（CAF）引起的基质硬化通过激活YAP来增强胃癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性（11）。然而，这项研究的起始因素是CAF的旁分泌效应；此外，YAP通路的激活仅依赖于机械感知通路，这与本研究提出的调控通路不同。因此，在高基质硬度微环境中，存在多种增强药物耐药性的机制。迄今为止，大多数研究表明高基质硬度会增加肿瘤中的DDR，包括宫颈癌（65）、HCC（66, 67）和非小细胞肺癌（64）。此外，高硬度对细胞DSB修复的促进作用可能在不同细胞类型中存在差异（24）。尽管高基质硬度主要提高了HRR的效率，但其他类型的DSB修复（如NHEJ）也可能存在。有趣的是，一些在3D培养条件下的研究得出了相反的结果。从乳腺癌细胞衍生出的类器官在与柔软的细胞外基质（ECM）相互作用时，会增强对化疗和电离辐射的抵抗力（68）。此外，位于低硬度水凝胶中的鼻咽癌细胞也表现出显著的抗辐射能力（69）。某些肿瘤细胞在抗辐射能力上的这些差异可能与不同的细胞培养方法有关。同时，细胞间的相互作用和物理屏障也可能对化疗和放疗的疗效产生一定影响。然而，这项研究也存在一些局限性。首先，由于病例数量较少，对肝细胞癌（HCC）患者的生存分析受到了限制；接受经导管肝动脉化疗（TACE）治疗的患者大多处于疾病的中晚期阶段，只有在符合手术指征和标准的情况下，才有少数患者取得了较好的治疗结果，因此在临床中很难从这些患者身上获取肿瘤组织样本。其次，除了已提出的DNA修复途径外，还不能排除其他可能的DNA修复途径，这需要在未来进一步探索。

### 结论

本研究成功开发了一种用于筛选和鉴定膜蛋白中新型机械传感器的标准方法，并发现了两种新的HCC机械传感器（SDC4和PKD2）。同时，它还揭示了在基质硬度增加的条件下，这两种机械传感器通路之间存在协同作用，从而增强了DNA修复（DDR）过程。具体来说，SDC4和PKD2通过促进PP2A的组装和活化，共同调节了基质硬度对BANF1核转位的影响；而核内的BANF1又进一步促进了MRN复合体的形成及其下游效应子的磷酸化，从而改善了DNA修复过程。据我们所知，这是首次报道两种不同的机械传感器通路在HCC中协同促进DNA修复的现象。

### 数据可用性

本研究生成的数据包含在文章及其补充文件中。本研究中的蛋白质组数据已在iProX平台上公开发布（编号PXD081109）。本研究中使用的ECM-受体相互作用基因集来源于KEGG数据库（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/KEGG_ECM_RECEPTOR_INTERACTION）。所有其他原始数据均可向相应的作者请求获取。

### 作者声明

作者们均未报告任何利益冲突或相关披露信息。

### 作者贡献

- 李J：数据整理、软件使用、数据分析、验证、研究、可视化、初稿撰写。
- 任Z：数据整理、数据分析、验证、研究。
- 姚J：资源提供、验证。
- 赵Y：验证、研究。
- 徐Y：研究。
- 余H：研究。
- 黄C：验证。
- 王M：验证。
- 姚F：验证。
- 李M：资源提供。
- 王Y：资源提供。
- 高D：资源提供。
- 赵Y：资源提供。
- 刘B：资源提供。
- 王Z：资源提供。
- 董Y：资源提供、资金筹措、研究。
- 陈R：概念构思、资源提供、数据整理、项目管理、稿件审阅与编辑。
- 崔J：概念构思、资源提供、资金筹措、稿件审阅与编辑、项目管理。

### 致谢

本研究得到了国家自然科学基金（82473492）的支持。本文的补充数据可在Cancer Research Online网站（http://cancerres.aacrjournals.org/）上获取。