高通量筛选（HTS）中混样（Pooling）设计与分析策略：面向新型抗微生物药物发现的应用研究

《Statistics in Medicine》：Design and Analysis Strategies for Pooling in High Throughput Screening: Application to the Search for a New Anti-Microbial

　　

细菌对抗生素的耐药性不断增强是一个重大公共卫生问题。所需应对措施的重要组成部分是发现和开发新的抗微生物策略（antimicrobial strategies）。这些策略需要对潜在新药进行筛选，通常通过高通量筛选（high-throughput screening, HTS）完成。传统上，HTS 通过每孔检测一个化合物来实施，但一种更高效的策略是在每孔中混样（pooling）多个化合物。在本工作中，研究人员研究了几种近期提出的混样构建（pooling construction）方法，以及多种混样高通量筛选（pooled HTS）分析方法，以便为实践者应使用哪些方法提供指导。该工作是在将这些方法应用于寻找抗细菌感染新药的背景下开展的。研究人员讨论了一项广泛的预试验（pilot study）以及一项小型筛选活动（screening campaign），并强调了混样方法的成功与挑战。

论文主体解读

研究背景方面，细菌对抗生素耐药性上升是重大公共卫生问题，联合国估计到 2050 年每年将有 1000 万人死于抗微生物耐药。鼠伤寒沙门菌（Salmonella enterica）每年导致超过 100,000 人死亡，非鼠伤寒沙门菌是美国食源性疾病死亡主要原因，并在发展中国家导致腹泻死亡。CDC 和 WHO 呼吁开发新药。Schwieters 等报道甘露醇-1-磷酸 5-脱氢酶（mannitol-1-phosphate 5-dehydrogenase, MtlD）在多种细菌中有抗菌潜力。MtlD 将 mannitol-1-phosphate 转化为 fructose-6-phosphate；mtlD 突变体在甘露醇存在时积累 mannitol-1-phosphate，导致中毒、生长降低和动物模型中毒力减弱。因此目标是找到在甘露醇存在下抑制 MtlD 的化合物。用野生型（wild-type, WT）菌时，MtlD 抑制导致不生长；许多化合物会因非 MtlD 原因抑制 WT，因此并行使用 mtlA 突变体（MUT），它不能形成 mannitol-1-phosphate，不受 MtlD 抑制剂伤害。能抑制 WT 但不抑制 MUT 的药物称为真命中（true hit），同时抑制 WT 和 MUT 的称为伪命中（pseudo-hit）。此前单复孔、一孔一化合物（one-compound-one-well, OCOW）筛选 10,000 个化合物，140 个似抑制 WT，其中 40 个不抑制 MUT，但复测未验证任何 true hit。若扩大到数十万化合物，即使 1% 假阳性也很昂贵。因此考虑混样（pooling），每孔多化合物，可提高通量或统计效率。研究者认为每池 8 个化合物可行，且预期 true hit 极稀疏，化合物间交互作用除非多个 true hit 同池，否则不太可能。挑战是自动化液体处理将源板化合物按设计转移到靶板，比 OCOW 更耗时，且需统计学家与实验人员沟通。

研究人员开展了设计、分析比较和真实抗菌筛选。目标包括比较混样 HTS 设计策略和分析策略，回答若开展混样高通量筛选应选何种设计与分析方法；并提出利用效应方向知识的新 Lasso 阈值方法，以及减少假阳性的二次分析方法。结论是推荐约束行筛选设计（Constrained Row Screening, CRowS）和 α-specific Gauss-Lasso，结合二次标准可显著减少需验证的假阳性，同时检测大效应；在抗菌筛选中展示成功与挑战，具有重要意义。

关键技术方法简述：研究采用 384 孔板，每板 320 孔用于池，每池约 8 个化合物。设计方法包括 CRowS、矩阵增强混样策略（Matrix-Augmented Pooling Strategy, MAPS）和随机池（Random pools）。分析方法包括基于最小绝对收缩和选择算子（least absolute shrinkage and selection operator, Lasso）的 Gauss-Lasso、α-specific Gauss-Lasso、非负 Gauss-Lasso 和弹性网（Elastic Net）。通过模拟比较 13 种分析方法，评估真阳性率（true positive rate, TPR）、假阳性率（false positive rate, FPR）及 log(TPR/FPR)。二次标准根据化合物所在池是否一致且显著抑制筛选。化合物来源包括 MedChem Express Diversity 库（5,000 Scaffold Library; Cat. No.: HY-L902）和 ChemBridge Macrocycle Library（100,000 Macrocycles; 2018 version; N1558-1）。

研究结果按原文小标题概述如下。

1 Introduction（引言）：研究人员指出抗生素耐药性上升，联合国预计 2050 年每年 1000 万死亡；鼠伤寒和非鼠伤寒 Salmonella enterica 感染严重。CDC 和 WHO 呼吁新药。HTS 传统一孔一化合物，混样多化合物可提高通量或统计效率，但存在争议；近期有成功混样筛选。本研究增加应用、设计/分析比较、提出 Lasso 阈值和二次分析。

2 The Screening Problem（筛选问题）：Schwieters 等报道 MtlD 有抗菌潜力，mtlD 突变菌在甘露醇中积累 mannitol-1-phosphate 中毒，毒力减弱。筛选目标是抑制 WT 而不抑制 mtlA MUT 的 true hit。此前 OCOW 筛 10,000 化合物，140 抑制 WT，40 不抑制 MUT，复测未验证。混样每池 8 化合物可行，true hit 稀疏，交互作用低。挑战是液体处理与沟通。

3 Design and Analysis Methodologies（设计与分析方法）：目标是比较混样 HTS 设计与分析。主效应模型。3.1 Designs（设计）：三种设计。3.1.1 Constrained Row Screening Designs（约束行筛选设计）：Smucker 等 CRowS 基于超饱和设计准则，限制最大池大小，构造快；小池时每行常恰好池大小。3.1.2 Matrix-Augmented Pooling Strategy（矩阵增强混样策略）：Ji 等 MAPS 用压缩感知，要求最小列包含数，遗传算法构造数小时。3.1.3 Random Pools（随机池）：Liu 等随机池，强约束，类似 CRowS，构造秒级。3.1.4 Comparing the Methods（方法比较）：384 孔，每板 320 孔，随机与 CRowS 相似，MAPS 不尊重行约束可能较差，CRowS 准则最好且多数 MAPS 准则也好。3.2 Analysis Methods（分析方法）：弹性网一般估计。3.2.1 Gauss-Lasso：中心化/标准化，Lasso 解，阈值小估计，普通最小二乘（ordinary least squares, OLS）再拟合，贝叶斯信息准则（Bayesian information criterion, BIC）选模型；四种版本。3.2.2 α-specific Gauss-Lasso：利用命中为抑制，阈值正估计和绝对值小于 α 的负估计。3.2.3 Non-Negative Gauss-Lasso：系数≥0。3.2.4 Elastic Net：混合参数，3 折交叉验证，1000 次置换，计算类似 p 值量。比较 13 种分析方法。

4 Comparing Pool Construction and Analysis Strategies（比较池构建与分析策略）：4.1 Simulation Framework（模拟框架）：设计大小模拟；模型假设稀疏；效应大小变化；评估 TPR、FPR、log(TPR/FPR)；1000 次模拟，doParallel 4 核，共 520 条件。4.2 Simulation Results for Pool Construction Comparisons（池构建比较模拟结果）：平均 log(TPR/FPR)，CRowS 略优于 MAPS（4.71 对 4.64）。CRowS 与 Random 在完全平衡时等价，Random 不可用于不平衡。无设计全面支配；除某设置外相似；CRowS 优于 MAPS 在某设计；推荐 CRowS。4.3 Simulation Results for Comparisons of Analysis Methods（分析方法比较模拟结果）：13 方法平均 log(TPR/FPR)，阈值越大越好；α-specific Gauss-Lasso 总体最好，较优阈值。Elastic Net 的 TPR 最大但 FPR 大，log(TPR/FPR) 最差。Gauss-Lasso Unknown 折中。应用需减少假阳性，故选 α-specific Gauss-Lasso。4.4 Secondary Criteria（二次标准）：初级分析后选池一致且有意义抑制的化合物。定义 well 抑制为低于 μ₀ 减去某值；考虑不同 well 数和标准偏差（standard deviation, SD）阈值。模拟显示更严格标准使 TPR/FPR 均下降，FPR 大幅降低；适合大规模筛选，但牺牲小/中效应检测。

5 Designing and Analyzing the Anti-Microbial Screens（设计与分析抗微生物筛选）：5.1 Proof-of-Concept Screening Results（概念验证筛选结果）：用已知 pseudohit Carbenicillin（CntP1A03）和 true hit Chloramphenicol（CntP1A04）加标；MedChem Express Diversity 库。CRowS 设计几组。结果在较不激进设置中混样有效，识别 CntP1A04；更激进设置每化合物 2 或 3 池统计信息不足。计划进入筛选。5.2 Screening Results（筛选结果）：16 块板 PLINGS，ChemBridge Macrocycle Library，每 PLING 640 个化合物，总 10,240。预期 true hit 罕见，约 1/100,000。数据有挑战：MUT 与 WT 中心不同，因甘露醇利用。用 profile plots 和 α-specific Gauss-Lasso，初始 hitlist 1.1% 潜在 hit，超过 100 个。二次标准（3/4 池超过 2 或 3 SD）得 8 个化合物，其中 2 个满足 3 SD。尚未验证 true hit，但在加标阳性对照中有效，真实弱 hit 未验证。

6 Discussion（讨论）：设计比较推荐 CRowS，有灵活性和统计基础。分析推荐 α-specific Gauss-Lasso，因低 FPR，适合减少验证成本；若需更多小效应可用 Elastic Net 或 Gauss-Lasso Unknown，但假阳性多。二次标准减少假阳性。交互作用模拟显示，FPR 升高但仍较低，3σ 效应 TPR 约 95%，比无交互下降不足 5%。化学聚集和交互需更多关注。真实实验证明强 hit 可检测。

研究结论部分翻译：在本工作中，一个主要贡献是为高通量筛选中的混样实践者提供关于池构建方法和筛选分析方法的指导。在此过程中，研究人员引入了两种对既有分析方法的改进，以契合将假阳性降低至接近零的目标。研究工作的第二个贡献是将这些方法应用于一个现有的、持续进行的生物医学研究挑战。该问题为细菌对抗生素耐药性的不断增加，而一种可能的解决方式是抑制一种酶，该酶可中和许多细菌中化合物 mannitol-1-phosphate 的毒性积累。研究人员展示了所研究的设计和分析方法如何在实践中使用，包括一项包含对照的广泛预试验和一项小型筛选活动。如此广泛的实验为真实世界数据中必须面对的挑战和折中提供了洞见。设计方法比较中，推荐 CRowS 方法；分析比较中，推荐 α-specific Gauss-Lasso；若需检测更多较小效应，Elastic Net 或 Gauss-Lasso Unknown 更受偏好，但假阳性增加。交互作用模拟显示推荐方法在实质交互存在时仍稳健。真实实验证明强 hits 可检测。