面向复杂样品的验证型阴离子交换高效液相色谱法：超螺旋小环DNA（sc mcDNA）与亲本质粒（PP）及RNA的分离与定量

《Journal of Chromatography A》：Validated chromatographic method for mcDNA quantification in complex samples

　　

用于复杂样品中小环DNA（mcDNA）定量的验证型色谱方法。新型验证型阴离子交换色谱（AEX）方法用于mcDNA定量。将超螺旋（sc）mcDNA与开环（oc）mcDNA异构体、亲本质粒（PP）和RNA分离。该方法在10–100 μg/mL浓度范围内具有选择性、线性、准确性、精密度和灵敏度。

小环DNA（mcDNA, minicircle DNA）的准确定量在基因治疗、DNA疫苗接种和分子生物学研究中具有重要意义。mcDNA是缺乏细菌序列的小环状DNA分子，与质粒DNA（pDNA, plasmid DNA）相比，具有更高安全性、更高转染效率和更持久的宿主细胞表达，因此是非病毒基因递送的理想载体。其生产基于体内重组，但除mcDNA外还会产生亲本质粒（PP, parental plasmid）、小质粒（mP, miniplasmid）、RNA和基因组DNA（gDNA, genomic DNA）等类似DNA种类，增加样品复杂性，并对纯化、表征和剂量控制构成挑战。开发稳健分析方法对评估产品纯度和批间一致性、满足美国食品药品监督管理局（FDA, Food and Drug Administration）对DNA基生物药的杂质标准十分关键。现有方法多估计总DNA浓度、根据纯度比推断mcDNA水平，或通过PP间接定量，在mcDNA与PP、mP、RNA和gDNA共存的复杂混合物中并不可靠。色谱技术已用于核酸分离、分析和定量，包括尺寸排阻色谱（SEC）、离子对反相色谱（IP-RP）、阴离子交换色谱（AEX）、slalom色谱、亲和色谱、亲水作用色谱（HILIC）和毛细管凝胶电泳等；疏水作用色谱（HIC）虽可用于pDNA纯化，但存在高盐负荷、脱盐步骤和柱寿命等问题。cadaverine修饰整体柱法存在批次变异风险；SEC法虽可获得一定回收率和纯度，但选择性和峰分辨率不佳。因此，研究人员采用编码肿瘤抑制蛋白p53的p53-mcDNA载体，探索阴离子交换高效液相色谱（AEX-HPLC, anion-exchange high-performance liquid chromatography）用于mcDNA定量。

关键方法方面，研究人员以E. coli ZYCY10P3S2T菌株来源的p53-mcDNA、p53-PP富集样品及含RNA复杂裂解物为样本；采用AEX-HPLC，使用TSKgel DNA-NPR柱（75 mm及定制120 mm），260 nm检测；流动相为20 mM Tris-HCl（pH 7.0）与1.0 M NaCl的20 mM Tris-HCl（pH 7.0），优化梯度为0–1 min 50% A，1–11 min 50%→35% A，11–32 min 35% A，32–35 min 35%→50% A，35–40 min 50% A，流速0.7 mL/min，进样25 μL；评估选择性、线性、准确度、精密度、检测限（LOD, limit of detection）、定量下限（LLOQ, lower limit of quantification）及复杂样品适用性。

研究背景指出，尽管mcDNA治疗相关性增强，但稳健且特异的定量方法仍然有限。方法建立需验证选择性、线性、特异性、精密度、准确度、LOD、LLOQ和重现性。最初使用?KTA Pure系统和75 mm TSKgel DNA-NPR柱，多种梯度、pH、流动相和流速条件均未能完全分离p53-mcDNA与p53-PP，但提供了有用信息。随后采用定制120 mm柱以提高分离效率，但因其产生约190 bar背压，超出?KTA Pure操作限制，后续改用可耐400 bar的Chromaster HPLC系统。最终优化条件实现了较好的分离，同时需权衡柱长增加带来的背压、峰展宽与灵敏度变化。

3.1 mcDNA选择性：研究人员以52 μg/mL的预纯化样品、p53-PP富集样品和空白进行选择性评价。空白中约1.00–1.20 min的峰归因于缓冲液转换。预纯化样品中，14.60 min主峰归为mc p53-mcDNA，15.65 min峰归为p53-PP，13.80 min小峰归为mP；20和25 min附近宽峰暂归为p53-mcDNA和p53-PP的线性异构体。p53-PP富集样品仅显示15.65 min峰，确认其中缺乏p53-mcDNA。电泳结果佐证上述归属。研究人员解释p53-mcDNA较小、总体负电荷少于较大的p53-PP，因此与阴离子交换配体作用较弱并较早洗脱；同时，超螺旋（sc, supercoiled）结构更紧凑，可提高有效电荷密度并增强与配体作用，说明多种因素共同影响保留。后期洗脱峰被研究人员与slalom色谱效应相联系。

3.2 线性评估：在1–100 μg/mL范围内分析预纯化样品，每个浓度重复3次。sc p53-mcDNA在13.15 min洗脱，开环（oc, open circular）mcDNA异构体在12.49 min，p53-PP在13.70 min。总DNA校准方程为Y=0.4853X–0.6859，R²为0.9994；sc p53-mcDNA校准方程为Y’=0.4857X’–0.4949，R²为0.9992。残差小且随机分布。总DNA在10–100 μg/mL范围内相对误差约10%；sc p53-mcDNA在7.027–65.001 μg/mL范围内相对误差低于10%，而0.815和1.478 μg/mL时相对误差约或超过30%。由于缺乏纯mcDNA标准，研究人员采用总DNA和sc mcDNA两种定量策略；但A₂₆₀名义浓度代表总DNA，并非物种特异性绝对mcDNA质量浓度。

3.3 方法准确度评估：研究人员使用总DNA方程评价预纯化样品，每个浓度重复3次。1 μg/mL相对误差最高，为105.93%；2 μg/mL变异系数（CV, coefficient of variation）最低，为0.45%，但相对误差为45.85%；50 μg/mL相对误差最低，为0.36%，但CV为8.12%。总体而言，在10–100 μg/mL范围内，方法准确度满足FDA推荐的±15%阈值。与已有研究相比，该方法验证范围延伸至100 μg/mL，宽于部分已报道方法。需注意，名义浓度由A₂₆₀测定，代表以双链DNA（dsDNA）当量表示的总DNA含量，而非独立确定的p53-mcDNA绝对质量浓度。

3.4 总DNA检测限与定量限：LLOQ确定为10 μg/mL，该浓度下CV为1.696%，平均相对误差为10.353%，低于FDA参考指南的20%限度；LOD确定为1 μg/mL，基于信噪比3:1。工作校准范围总DNA为10–100 μg/mL，方程为Y=0.4930X–1.2582，R²为0.9997；sc p53-mcDNA方程为Y’=0.4946X’–0.9164，R²为0.9995。与已报道LLOQ为1–5 μg/mL的方法相比，本方法LLOQ较高，研究人员将其归因于较长色谱柱提高分离度但可能造成峰展宽，从而降低低浓度样品信噪比。

3.5 方法精密度评估：研究人员以20、45和75 μg/mL样品评价日内和日间精密度，每个浓度重复3次。日内最高平均相对误差为75 μg/mL时的7.181%，最高CV为20 μg/mL时的4.734%；日间最高平均相对误差为45 μg/mL时的8.907%，最高CV为5.890%。这些值均低于FDA接受的15%范围，表明方法具有重复性和重现性。

3.6 复杂样品中p53-mcDNA评估：研究人员制备含p53-mcDNA、p53-PP、mP和RNA的复杂裂解物，以297.43 μg/mL进样。RNA在最初2 min内洗脱，mP在13.80 min、p53-mcDNA在14.60 min、p53-PP在15.70 min洗脱。结果表明RNA不干扰sc p53-mcDNA的选择性或定量。由两个独立实验并使用总DNA方程计算，sc p53-mcDNA含量为23.96 ± 1.21 μg/mL，约占样品核酸的10%。局限性在于，校准所用名义浓度来自A₂₆₀，代表总UV衍生DNA（p53-mcDNA、p53-PP和mP）的dsDNA当量，而非独立确定的质粒质量；复杂样品中各物种比例可能不同。因此，结果应报告为相对于A₂₆₀的表观浓度，而非p53-mcDNA绝对质量浓度；峰面积百分比也不应解释为绝对纯度，尤其在含RNA样品中。该方法支持进一步用于过程监测，但需验证峰身份、基质效应、校准策略和方法转移性。

讨论部分总结认为，该方法在测试条件下实现了p53-mcDNA与p53-PP的高分辨率分离。研究首次开发了采用定制商业化阴离子交换柱分离和定量评估p53-mcDNA样品的方法，并在总DNA 10–100 μg/mL范围内获得与指南一致的线性、精密度和准确度，LLOQ和LOD分别为10和1 μg/mL。方法也适用于含RNA的复杂混合物，因为各物种分开洗脱且不干扰检测或定量。更广泛应用前，仍需使用物种特异性参考物质进行进一步验证，并开展正式的稳健性和方法转移研究。

研究结论翻译：在本工作中，研究人员提出了一种新的采用AEX-HPLC进行p53-mcDNA定量和分析的色谱方法。在总DNA浓度为10–100 μg/mL范围内，线性、精密度和准确度与国际指南良好一致，LLOQ和LOD分别确定为10和1 μg/mL。总体而言，结果确认所开发的色谱方法在DNA浓度工作范围内提供可靠的准确性，对DNA基产品的加工具有潜在相关性。研究还证明该方法适用于含RNA的更复杂混合物中的p53-mcDNA定量，因为各物种分开洗脱，并且不干扰其他质粒分子的检测或定量。本研究首次开发了采用定制商业化阴离子交换柱分离和定量评估p53-mcDNA样品的方法。在更广泛实施前，需要用物种特异性参考物质进行进一步验证，并进行正式的稳健性和转移研究。然而，该方法在测试条件下实现了p53-mcDNA与其亲本质粒的高分辨率分离，并可能支持上游和下游操作期间的过程监测。