非共价相互作用驱动的自组装赋予界面β-乳球蛋白淀粉样纤维对脂质水解酶的抑制活性

《Journal of Colloid and Interface Science》：Noncovalent interaction-driven self-assembly endows interfacial β-lactoglobulin amyloid fibrils with inhibitory activities against lipid-hydrolyzing enzymes

　　

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  CP处理可调控β-LG纤维化，增强β-折叠含量和疏水性。
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  P-β-LGF形成了细长的纤维，与酶之间形成"葡萄串"式多价结合。
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  P-β-LGF对PL表现出竞争性抑制作用，对CE表现出混合型抑制作用。
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  静电相互作用、疏水聚集和氢键驱动P-β-LGF与酶的相互作用。
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  P-β-LGF在体外抑制脂质水解，有望用于肥胖管理。

引言

肥胖正被视为一种全球性健康问题，其成因包括机体代谢紊乱或过量摄食，导致体内脂肪过度积累[1]。研究发现，肥胖患者更容易患上糖尿病、心血管疾病及其他慢性疾病[2]。胰脂酶（PL）和胆固醇酯酶（CE）是体内参与膳食脂质消化和吸收的两种关键酶，它们通过促进脂质消化为可吸收分子（如脂肪酸（FAs）、总胆固醇和甘油）发挥作用。PL负责消化膳食脂质（约占70%），将甘油三酯底物转化为游离脂肪酸和单甘酯。据报道，PL的过度活性会促进肥胖的发展[3]、[4]。CE是一种羧酸酯水解酶，主要存在于胆汁中，可将胆固醇酯水解为游离胆固醇和脂肪酸，未酯化的游离胆固醇和脂肪酸容易从肠道吸收入血[5]。因此，针对PL和CE的抑制作用被广泛视为减少膳食脂质或胆固醇吸收、抑制肥胖发展的有效策略。目前，传统的药物治疗主要包括合成抑制剂（如辛伐他汀和奥利司他），常被用于降低脂质水平。然而，长期使用这些抑制剂会引起胃肠道副作用（如腹胀、消化不良和腹泻），且成本高，限制了其广泛应用[6]、[7]。因此，探索这些化学合成抑制剂的替代品——来源于天然来源、具有更好生物相容性、成本效益更高且更安全的酶抑制剂——显得尤为重要。食品来源的生物活性物质的潜力，主要在于其延缓脂质水解的功能性及良好的安全性，已得到广泛关注。Zhao等（2024）证明，富集疏水氨基酸的红豆水解物能够对参与脂质降解的PL和CE产生双重抑制作用[8]。Ye等（2023）发现，茶叶来源的三肽对脂质水解酶的抑制效果接近药物基准水平[9]。

β-乳球蛋白（β-LG）是反刍动物乳中乳清蛋白的主要组分，是一种球蛋白状可溶性蛋白，含有162个氨基酸的单肽链，单体分子量为18.3 kDa，具有多种健康益处（如抗癌、抗氧化、抗高血压和抗糖尿病特性）[4]、[10]。β-LG是生物活性肽的重要来源，这些肽据推测具有抗肥胖、抗糖尿病和抗高血压活性[11]。研究结果表明，这些生物活性肽可与酶结合并调节其催化活性，从而延缓脂质水解。除酶解外，β-LG还可自组装为富含β-折叠结构的淀粉样纤维，这些纤维具有极端的纵横比、构象稳定性、丰富的表面官能团和优异的界面活性，为与大分子（如消化酶）的相互作用提供了有利界面[12]、[13]。淀粉样纤维的形态显著影响其应用。传统纤维化过程的长时间加热消耗大量能源和时间。因此，不同的技术（如物理法、酶法和金属离子处理法）已被应用于控制形态和结构、缩短反应时间和促进蛋白质纤维化。在这些方法中，物理法是一种安全、环保且高效的改性方法。介质阻挡放电大气冷等离子体（DBD ACP）可在无需化学试剂或溶剂的情况下改变蛋白质结构和功能特性。在CP处理过程中，载气在高能电场下电离产生活性氧氮物种。活性物种与水相互作用可形成长寿命（H₂O₂和O₃）和短寿命（•OH、O₂^?和O₂•）的活性氧物种（ROS）[14]、[15]。蛋白质纤维生长动力学遵循类S形曲线，包含三个不同阶段，即滞后期（蛋白质在酸性环境和高温下可发生解折叠和水解，转化为寡聚体（成核体））、指数期（成核体作为模板快速自组装为原纤维，直至蛋白质单体浓度降至极低水平）和饱和期（原纤维组装为具有显著长度和优异刚性的成熟纤维）[12]、[16]。研究表明，每个阶段需要不同的能量水平，这为通过外部能量源在纤维化过程的不同阶段精确调控蛋白质纤维化提供了可能性。CP处理可导致形成非淀粉样原级的超分子组装体和复合物，其中β-折叠含量较低，偏离经典淀粉样状态[17]、[18]。在蛋白质纤维化过程中，CP处理可被认为能够加速该过程。经CP处理的蛋白质纤维表现出多样的形态和优异的技术功能特性[19]。然而，CP处理在纤维化过程不同阶段对β-LG纤维（β-LGF）生长的具体影响，以及其结构和功能特性，尚未得到充分阐明。

最近，一些研究表明某些蛋白质纤维可调节脂质消化和吸收以控制肥胖[20]、[21]。然而，现有研究大多侧重于评估抗肥胖的抑制效果，而蛋白质纤维与酶相互作用的基础机制研究仍显不足。特别是，蛋白质纤维与消化酶催化区域在分子水平上的相互作用尚未得到清晰阐明，纤维内部特定的结构修饰是否参与介导酶抑制活性也需进一步探究。根据我们的初步预实验，β-LG水解肽几乎对PL没有抑制作用，而β-LGF在较低浓度下对CE表现出相似的抑制效果（图1A和B）。这可能解释为：富含β-折叠的纤维状结构的β-LGF允许在酶催化活性位点之外进行多价延伸结合，从而限制酶有效催化所需的动态构象和底物可及性。

本研究利用CP处理在β-LG纤维化过程的三个特定阶段进行调控，即纤维化初始阶段（t0）、滞后期结束（t0.1）和指数期结束（t0.9）。对CP调控的β-LGF的生长动力学、分子量、二级结构、表面疏水性、形态、乳化性能等进行了全面表征。阐明了CP处理对β-LGF聚集动力学和形态的影响及其相应机制。此外，探讨了CP处理后的β-LGF（P-β-LGF）对PL和CE的抑制效果，并通过抑制动力学、多光谱分析、等温滴定量热法（ITC）等手段评估了相互作用机制。通过分子对接技术进一步鉴定了潜在结合位点和相互作用类型。通过在食品基质（食用植物油）中分析P-β-LGF对体外脂质消化的影响，评估了其功能性。这些发现有望为增进对P-β-LGF与脂质水解酶相互作用的理解提供新视角，并支持开发具有降脂潜力的功能性蛋白质基材料。

章节摘要

材料与试剂

β-LG（纯度≥95%，来源于乳），硫黄素T（ThT），PL（EnzymoPure，≥500 U/mg蛋白），CE（纯度≥90%，500 U/mg蛋白），溴化钾，8-苯氨基-1-萘磺酸（ANS），4-硝基苯丁酸酯（pNPB），胰蛋白酶（猪源，EnzymoPure，≥50 U/mg），猪脂肪酶（EnzymoPure，≥2500 U/mg），胃蛋白酶（EnzymoPure，≥2500 U/mg），胰酶（EnzymoPure，≥10 U/mg），叔丁醇（TBA，纯度≥99%），1,4-苯醌（BQ，纯度≥97%），磷酸二氢钠（NaH₂PO₄，纯度≥

ThT荧光分析与聚集动力学

本研究将ThT荧光强度与反应时间的关系进行标准化处理，并通过AmyloFit软件拟合。可获得蛋白质纤维化的起始时间（t0）、滞后期结束时间（t0.1）和指数期结束时间（t0.9）的具体时间点（图2A）。在三个反应时间点经CP处理的β-LG纤维化过程表现出显著差异（图2B-D）。与对照组相比，P-β-LGF的生长速率随

结论

本研究证明，CP是一种有效工具，可精确调控β-LG在淀粉样形成不同阶段的纤维化行为。CP处理通过促进蛋白质解折叠、β-折叠形成和成核作用，显著加速了纤维生长早期阶段的纤维化动力学，同时改善了所得纤维的理化性质和界面性能。最优处理条件（在t0和t0.1时采用45 W，在t0.9时采用40 W）

CRediT作者贡献声明

宋公帅：撰写——初稿。杨映聪：验证。许震：调查研究。许子铭：数据管理。王丹丽：概念化。袁亭兰：验证。李玲：方法学。葛青：调查研究。袁海娜：验证。郑福平：资金获取。张梦娜：撰写——审阅与编辑。龚金燕：监督指导。

利益冲突声明

作者声明，不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究得到以下基金支持：国家自然科学基金（32302223）、杭州市自然科学基金（2025SZRJJ2132）、浙江省自然科学基金（LZ24C200006）、浙江省重点科技项目（2024C04020）、北京工商大学食品风味与健康交叉创新开放项目（FFHCI-2026061）、浙江华彩检测有限公司横向合作

宋公帅|杨映聪|许震|许子铭|王丹丽|袁亭兰|李玲|葛青|袁海娜|郑福平|张梦娜|龚金燕