《Advanced Functional Materials》：Endosomal Escape of siRNA Polyplexes: A Molecular Dynamics Perspective on Underlying Mechanisms
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摘要
为实现治疗效果，递送核酸的纳米颗粒必须促进其载荷的内涵体逃逸（endosomal escape, EE）。尽管已有大量研究，但实现有效EE的机制仍未得到充分理解。本研究在体外比较了四种聚合物制剂（聚复合物）和一种脂质纳米颗粒（lipid nanopart
摘要
为实现治疗效果，递送核酸的纳米颗粒必须促进其载荷的内涵体逃逸（endosomal escape, EE）。尽管已有大量研究，但实现有效EE的机制仍未得到充分理解。本研究在体外比较了四种聚合物制剂（聚复合物）和一种脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle, LNP）的EE行为。同时，研究人员利用全原子（all atom, AA）和粗粒化（coarse grained, CG）分辨率的分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟，以区分这些制剂与内涵体膜的相互作用。所识别的相互作用模式与制剂的体外性能进行了对照讨论：一方面，结果强调了纳米颗粒中疏水性残基的益处；另一方面，MD模拟证明了生物膜中阴离子脂质的作用。模拟中可视化了聚复合物制剂与内涵体膜的不同相互作用模式，旨在区分潜在的EE机制。本研究凸显了MD模拟在分子水平上解释体外观察差异以及更好地理解EE效率方面迈出的重要一步。
论文解读：siRNA聚复合物内涵体逃逸的分子动力学机制研究
一、研究背景与科学问题
小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）通过结合细胞质中的RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）来下调靶向致病基因的表达。然而，siRNA在内涵体途径中的逃逸是发挥治疗效应的关键瓶颈。尽管已有多种机制被提出，包括经典的“质子海绵”理论、聚复合物溶胀导致的膜破裂假说，以及聚合物-膜直接相互作用形成局部孔洞的机制，但EE过程仍未在分子水平上被充分理解。脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle, LNP）虽已成功进入市场（如Onpattro），但其EE效率仍然有限，仅有个位数百分比的siRNA分子能到达细胞质。聚合物基聚复合物普遍存在EE效率低下的问题，制约了核酸递送技术的发展。分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟能够在分子水平揭示复杂制剂与生物膜的相互作用机制，有望填补对EE机制理解的空白。然而，以往研究缺乏将多种制剂的MD模拟结果与体外实验数据进行系统关联的工作。
二、研究目标与假设
本研究提出三个具体目标：第一，对四种聚复合物和一种LNP制剂，建立纳米颗粒-膜相互作用的定量MD描述符，并检验其是否与实验测定的EE效率和基因沉默效率相关；第二，检验疏水性融合型相互作用（而非单纯静电附着）是否为区分高效逃逸制剂与无效制剂的关键特征；第三，考察全原子（all atom, AA）与粗粒化（coarse grained, CG）两种分辨率是否在研究的多种内涵体-溶酶体膜组成下提供一致的机制图景。研究人员假设所有阳离子制剂均能通过静电作用结合内涵体阴离子脂质，但只有携带足够疏水特征的制剂才能插入并重塑脂质双分子层，这种疏水驱动的膜融合与体外观察到的有效逃逸机制相关，而纯静电结合制剂在可及的模拟时间窗口内无法实现逃逸。
三、关键技术方法
研究人员比较了四种聚复合物制剂和一种Onpattro样LNP制剂。四种聚复合物包括：25 kDa支化聚乙烯亚胺（branched polyethylenimine, bPEI）；bPEI-聚己内酯（polycaprolactone, PCL）-bPEI三嵌段共聚物（PPP）；以及两种不同疏水性的两亲性聚（β-氨基酯）（poly(beta)aminoester, PBAE）共聚物（70%油胺OA和30% OA）。体外实验在HeLa/eGFP细胞中进行eGFP敲低效率评估，通过Galectin-8（Gal8）招募实验量化EE效率，并通过红细胞溶血实验评估膜相互作用。模拟方面，采用Martini 3力场进行CG-MD模拟，构建四种不同阶段的内涵体-溶酶体膜模型（早期内涵体、脂筏、晚期内涵体、溶酶体），以及全原子MD模拟（charmm36力场），并通过伞形采样计算聚合物的辛醇-水分配系数（log P）。所有CG模拟在Gromacs 2021.4-plumed中运行。
四、研究结果
4.1 纳米颗粒的表征
体外实验中，所有五种制剂均形成粒径50-70 nm、多分散指数低于0.3的颗粒。聚复合物的ζ-电位为正值，而LNP呈轻微负电荷。CG模拟中，聚复合物通过自组装形成直径约10-18 nm的稳定纳米颗粒。值得注意的是，30% OA PBAE有20%的聚合物在pH 5.4和7.4下均未结合到聚复合物上，最终N/P比约为8。
4.2 颗粒的体外比较
在HeLa/eGFP细胞中，70% OA PBAE聚复合物和LNP表现出最高的敲低效率（30-60%），而其他聚复合物制剂在同一剂量下未实现敲低。在调整剂量使细胞摄取水平相当的条件下，70% OA PBAE聚复合物引起的Gal8招募显著高于所有其他制剂，表明其EE效率最高。LNP虽实现了高敲低效率，但Gal8招募水平较低，这可能源于其EE机制本身——离子化脂质DLin-MC3-DMA不诱导半乳凝素招募，可能仅形成小的膜孔。红细胞溶血实验显示，70% OA PBAE仅在pH 5.4时引起显著溶血，表明其在酸化的内涵体-溶酶体 compartments中膜相互作用增强。
4.3 膜相互作用机制的分子区分
CG-MD模拟中，70% OA PBAE和LNP表现出明显的疏水相互作用，聚合物/LNP脂质插入膜疏水核心，导致膜脂与颗粒材料的混合。这两种高效制剂还能从膜平面提取脂质。相反，30% OA PBAE、bPEI和PPP仅引起轻微的膜密度分布变化。通过伞形采样计算的log P值排序为：70% OA PBAE > PPP > 30% OA PBAE > bPEI，但log P与EE性能之间未发现明确的相关性。所有聚合物均优先与阴离子脂质相互作用，这在AA和CG模拟中均得到证实。脂筏模型中，由于负电荷局限于糖基化层，聚合物无法在头部基团区域获得负电荷，导致无永久性聚合物吸附。
4.4 纳米颗粒与膜囊泡的相互作用
在膜囊泡模拟中，LNP与膜融合导致脂质快速交换和膜紊乱，在8次模拟中仅1次观察到siRNA逃逸事件。70% OA PBAE聚复合物引起与LNP类似的膜扰动，聚合物分子逐渐解组装并分布于整个囊泡，但未观察到siRNA逃逸。30% OA PBAE的膜扰动作用较弱，以表面静电接触为主。bPEI聚复合物未脱落任何聚合物，膜相互作用极小。PPP聚复合物的PCL段可插入膜脂尾区，但若bPEI段先附着于膜表面则阻碍疏水相互作用。定量分析显示，70% OA PBAE与膜脂的接触数比bPEI高18.6倍（溶酶体膜）至52.8倍（早期内涵体膜），定性上反映了体外敲低效率的排序。聚合物-siRNA接触比较显示，30% OA PBAE聚复合物稳定性最低，PPP聚复合物稳定性最高，且疏水性增加与解组装减少相关。
五、结论与讨论
本研究表明，所有阳离子制剂均对阴离子膜脂质具有增强的亲和力，但只有70% OA PBAE聚复合物和Onpattro样LNP在体外实现eGFP敲低，这两种制剂是唯一在MD中形成大量疏水相互作用、从平面膜提取脂质并扰动膜囊泡的颗粒。研究将聚复合物的EE机制理解为从质子海绵样EE到膜融合主导机制的谱系：亲水性聚合物（如PEI）通过静电驱动附着于内涵体膜，可能通过渗透压或机械应力积累实现较罕见的逃逸事件；而疏水修饰增强的聚合物可同时利用质子海绵和膜融合机制，实现更高的EE效率，但也可能因过度内涵体破坏而具有细胞毒性。LNP通过膜融合实现高效EE且仅产生小孔，不触发Gal8招募，其EE机制在细胞毒性方面更为理想。研究强调，由于MD模拟在尺寸和时间尺度上的限制，所呈现的结果仅捕捉了EE的初始膜-颗粒相互作用，但通过分析不同制剂与内涵体膜的分子相互作用，MD模拟能够为EE机制提供有价值的机制性指示，并有助于对体外结果进行结论性解释。该研究发表在《Advanced Functional Materials》期刊上。
