挪威T?nsberg水浸中世纪毛皮（pelt）的蛋白质基因组学（proteogenomics）研究：综合蛋白质组学与古DNA（aDNA）鉴定为Ovis aries

《Journal of Archaeological Science: Reports》：Proteogenomic insights from a waterlogged medieval pelt from T?nsberg, Norway

　　

一件13^th世纪毛皮（pelt）发掘自挪威T?nsberg的水浸中世纪考古背景。综合蛋白质组学（proteomics）与DNA分析将该物种鉴定为Ovis aries。对毛发和皮肤提取物均进行了液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和古DNA（aDNA）条形码分析。独特肽（unique peptides）和mini-COI序列使研究人员能够进行可靠的分类学（taxonomy）归属。该研究展示了一套针对降解有机考古发现的稳健工作流程。

研究背景与问题。蛋白质组学和遗传分析的方法学进展显著扩展了考古学分析有机遗存的工具箱。生物分子考古中，残渣、骨、皮革、纺织品和毛皮（pelt）等成为可分析基质。蛋白质与DNA分析框架整合为蛋白质基因组学（proteogenomics），应用于考古材料时常被视为古蛋白质组学分支，本文简称考古蛋白质基因组学。其可重建古代生活方式、经济和技术实践，并在形态和背景降解时进行物种鉴定、死亡时生物属性、生产技术和易腐材料来源研究。皮肤和毛皮最难，主要含胶原（collagen）和角蛋白（keratins），易受微生物分解、氧化损伤和水解，考古保存罕见，多限于水浸、冷冻或厌氧环境，但其考古意义与古代经济、社会等级、家庭实践和贸易网络相关。T?nsberg是挪威东南中世纪城市，公认最早城市聚落之一。样本来自2014年8月25日至9月4日救援发掘，Trench 3，Storgaten与Tollbodgaten交叉附近，文化层年代为11^th世纪末至14^th世纪初。该文物为带毛鞣制皮碎片，出自K50黑褐色腐殖层，位于现代水管下约30 cm，有机质高、气味强、保存动物遗存丰富，包括软体动物壳、烧骨和中世纪绿釉陶瓷，显示水浸厌氧高保存。K50位于木结构K42上方，后者为中世纪角槽原木构造（laftehj?rne），最低木材放射性碳定年CE 1166–1210。陶瓷Scarborough（1150–1225 CE）和Langerwehe（14^th世纪）将组合锚定在12世纪末至14世纪初。宏观初步评估认为来自狐狸（Vulpes lagopus）或山羊（Capra hircus）。地层完整性和年代支持其为挪威High Medieval时期，且T?nsberg位于连接Viking和Hanseatic网络的海上贸易路线汇合处，参与毛皮贸易、捕鲸和纺织。研究旨在以该水浸带毛中世纪毛皮为test case，开发和验证面向文化遗产科学的整合蛋白质基因组学方法，克服单技术对降解动物源文物物种鉴定的局限；蛋白质组学可提供组织特异蛋白和肽标记，较耐成岩降解，支持形态相似类群分类，即使古DNA（ancient DNA, aDNA）过短碎片，但降解蛋白质组分类分辨率常限属级，aDNA在保存时更适合解决近缘系统发育关系，且受现代参考数据库偏好影响。整合证据可减轻限制，产生更稳健物种归属框架并提供方法学指导。研究人员对毛发和皮肤提取物进行了整合分析，结论为Ovis aries；该研究展示针对降解有机考古发现的稳健工作流程，并为脆弱有机文化遗产材料分析提供方法学指导。

关键技术方法。样本来源为挪威T?nsberg水浸中世纪带毛皮，Trench 3，Context K50，地层年代12^th–14^th世纪CE。方法包括：光学显微镜和扫描电子显微镜（SEM）评估形态；傅里叶变换红外光谱（FT-IR）ATR模式分析胶原和角蛋白保存及鞣制剂残留；蛋白质组学采用毛发和皮肤提取、FASP消化、nanoLC-MS/MS，并经MaxQuant迭代数据库搜索Mammalia、Ovis aries和Capra hircus，评估去酰胺化（deamidation）；aDNA采用CTAB裂解和氯仿纯化，扩增mini-COI（线粒体细胞色素c氧化酶亚基I短片段），两轮PCR加双索引，Illumina MiSeq 2×300 bp测序，CD-HIT 97%聚类，BLASTn比对。

研究结果。4.1 显微镜与FT-IR光谱：光学和扫描电镜显示毛发和下方皮肤保持整体结构完整性，可识别毛小皮鳞片模式和黏合真皮基质，与水浸厌氧沉积的有利保存一致；FT-IR显示蛋白质特征酰胺I和酰胺II带，约1636和1551 cm^?1，主要来自胶原和角蛋白，表明蛋白质基质 largely preserved，也指导发掘后处理和储存。4.2 蛋白质组学分析：对毛发和皮肤蛋白提取物进行bottom-up蛋白质组学和多步数据库搜索，将未知种缩小至Ovis aries或Capra hircus。Mammalia范围搜索鉴定18个蛋白组，归属6物种，主要为Ovis，几乎全为角蛋白、角蛋白相关蛋白和胶原；最终搜索鉴定125个蛋白。MaxQuant将35个种特异独特肽（unique peptides）分配给Ovis aries，26个给Capra hircus；90%总肽强度来自两者共享肽，9%来自绵羊“unique”肽，1%来自山羊。山羊分配肽并非真正独特：两样本51个distinct peptides中45个与当前UniProtKB Ovis aries条目中未包含在搜索参考蛋白质组中的序列相同（Leu/Ile等价），其余6个中5个与绵羊序列差一个残基，且映射到不同蛋白，符合数据库注释不完整及修饰或覆盖相关误配，而非真正山羊。Li et al.候选标记中，四个绵羊标记有三个检测到，两个山羊标记均未检测；但BLAST和Unipept重检显示三个绵羊标记不严格诊断：VESLKEELICLK广泛共享于哺乳动物，GLLDSEDTK也存在于细菌和鱼Sander lucioperca，LCCSVPTSPATTICSSDK特异于Pecora infraorder而非Ovis。结合绵羊分配肽强度明显高于山羊，毛发被限制在caprines，Ovis aries优于Capra hircus，并获aDNA独立支持。皮肤样本多步搜索对绵羊或山羊证据相等，但绵羊独特肽34个对山羊26个，故也分配Ovis aries。纳入去酰胺化后，内源角蛋白和胶原肽中24%天冬酰胺和28%谷氨酰胺残基发生去酰胺化（强度加权估计），而MaxQuant污染物条目为3%和4%，分类归属未受影响。4.3 遗传分析：通过两独立扩增产物高通量DNA测序，分别获得183,794和149,670条reads，97% identity聚类得383个约180 bp clusters。BLASTn对GenBank非冗余核苷酸数据库显示，低丰度clusters为环境污染物，包括蠕虫、昆虫和细菌来源非COI序列；少数哺乳动物序列中，最丰富clusters始终最高相似于Ovis aries，即使考虑DNA降解和扩增测序变异。其余哺乳动物样clusters reads少，解释为minor residual signals，可能来自环境污染物或测序artefacts，而非替代哺乳动物来源。最接近非Ovis属为Capra，最大identity 93%；约7%序列分歧高于动物种内COI变异（一般低于2%），符合Ovis和Capra在Caprinae亚科的深线粒体分歧。最丰富哺乳动物相关miniCOI cluster与Ovis aries 100%/100%匹配，与Capra aegagrus 98%/93.7%。该结果支持Ovis aries为样本最可能分类和生物来源。

讨论总结与结论翻译。讨论指出，蛋白质和遗传数据共同分析虽增强能力，但两者初步不一致可出现；除实验室污染外，主要有三因素。5.1 现代蛋白数据库对古代变异表征有限：数据库不完整并偏向研究充分物种；若古代样本物种或谱系蛋白未编目，质谱软件会把肽分配给最接近匹配，可能是不同物种。Brandt et al.维京时代毛皮研究中，肽初匹配alpine marmot因数据库缺Eurasian red squirrel，补充松鼠序列后正确；Eurasian beaver角蛋白序列缺失时，维京beaver pelt肽默认匹配North American beaver。数据库限制是明显蛋白质组/基因组差异的主要来源，需扩展参考数据库，解释蛋白质鉴定需谨慎，考古背景可帮助检查但避免循环推理。5.2 古代动物与现代品种或参考基因组遗传分歧：古代标本可能属于与现代群体遗传特征不同的种群或品种，数千年进化或选择育种造成氨基酸替换，罕见或缺失变异可致误鉴定；过去种内多样性可能更大，已灭绝谱系如中世纪landrace breeds存在，看似野近缘或其他物种的肽可能只是现代数据未代表的祖先变异。解决需扩展古代基因组序列或de novo蛋白测序。但在T?nsberg pelt中，mini-COI barcode与现代Ovis aries 100%一致，表明短进化时间尺度分歧可忽略，完整蛋白序列预期同样一致，物种归属不受影响。5.3 多物种和复合物体：皮肤和毛皮文物可因复合性质产生明显多物种信号，如其他生物材料蛋白（血液、奶、加工植物纤维）；毛皮斗篷可能用不同动物筋缝合，hide可能涂另一物种油，从而在主要pelt来自一个物种时产生多物种肽。研究人员通过仔细采样和比较蛋白与DNA谱来考虑。面对持续差异，可假设意外肽反映复杂taphonomy或原始多物种材料使用，而非分析错误。更广泛，garments and furs很少孤立使用或加工，一个主要来自某物种物品会与其他动物skins、wool、carcasses在wear、hide-working、slaughtering、cooking中一起，因此recovered proteome可能合法保留几个taxa痕迹而不暗示混合原料。T?nsberg标本未观察到次级信号，绵羊主导proteome与100% Ovis aries mini-COI汇聚，表明单物种带毛皮肤。总体，不一致本身有信息，可提示古代动物遗传或发育不同，或分析需更广参考框架。技术因素必须先排除：搜索设置如variable modifications、FDR（false discovery rate）阈值、precursor/fragment mass tolerances和allowed missed cleavages影响鉴定和taxa支持。某些翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs）和氨基酸替换等压或近等压：天冬酰胺和谷氨酰胺去酰胺化（+0.984 Da）产生天冬氨酸和谷氨酸，使去酰胺化肽质量上不可区分于Asp/Glu序列变异；甲基化（+14.016 Da）与Gly→Ala或Ser→Thr替换同样。考古角蛋白和胶原中去酰胺化频繁，未考虑修饰可产生spurious“species-specific”肽或掩盖真实，解释分类信息肽时必须明确考虑；本研究中风险通过BLAST/Unipept验证候选标记肽和独立aDNA证据减轻。实际，当aDNA和蛋白同一样本不同鉴定，明智是重访原始数据，扩展搜索到古代变异，考虑考古背景。发表研究通常发现细致分析后出现一致解释，常丰富理解。结论部分翻译：生物分子方法已革新Viking和medieval North European pelts研究。过去学者依赖碎片化视觉线索，现在研究人员从数百年皮毛提取DNA和蛋白序列，可靠确定动物来源。当前state of the art是跨学科结合：aDNA在保存允许时提供物种鉴定和系统发育见解，古蛋白质组学提供更耐降解的替代或互补窗口。二者共同阐明羊毛皮历史贸易，确认日常皮革制品使用家养物种，并揭示蛋白捕获的动物年龄和处理细节。蛋白质组和基因组数据大体一致；当分歧，研究人员认识到原因从数据库限制到真实古代生物差异，本身有启发性，需改进参考数据和整合分析。实际应用已走向考古pelt整体调查：显微、蛋白质组和遗传证据一起使用，描绘最完整图景。近期高知名度考古服装和纺织品研究展示采样微量材料并分给多种分析而不耗尽珍贵标本的协议，结果更稳健鉴定和更丰富数据集。随着古蛋白质组数据库、非侵入采样和DNA-蛋白数据整合改进，古代pelt分析准确性和范围将增强。过去十年文献尤其archaeometry和proteomics期刊反映学科成熟，可以科学精度处理追踪skins贸易网络或区分野生vs家养毛皮利用等问题。研究人员现在有工具重访旧博物馆毛皮和皮肤收藏并提取新信息，将Viking和medieval life长期沉默遗存带入新光。每次成功分析不仅识别古代pelt起源，也加强下一案例方法，建立过去生物和其组织沉积后命运的累积理解。总之，分析历史pelt的state of the art是跨学科创新故事，持续研究精炼技术，确保即使脆弱毛皮和皮肤发现也能稳健告知过去知识。