ACSF3介导的代谢编辑：生物素羧化下游malonate和methylmalonate解毒与线粒体代谢维持

《Journal of Biological Chemistry》：The malonyl-CoA synthetase ACSF3 is required for metabolic editing downstream of biotin carboxylation

Acsf3（一种线粒体malonyl-CoA synthetase）在人类先天性错误Combined Malonic and Methylmalonic Aciduria（CMAMMA）中发生突变。为阐明其在哺乳动物代谢中的作用，研究人员构建了Acsf3敲除（knockout，KO）小鼠。研究人员证明，Acsf3缺失导致malonate和methylmalonate浓度升高，并表现出预期的线粒体代谢缺陷，但KO小鼠大体健康，与人类先天性错误相似。Acsf3^KO小鼠表现出malonyl-CoA synthetase活性的冗余，提示疾病严重程度的遗传修饰因子。Malonate和methylmalonate是生物素依赖性羧化（biotin dependent carboxylation）副产物产生的代谢毒物，需要代谢编辑（metabolic editing）。的确，生物素连接酶全羧化酶合成酶（Holocarboxylase Synthetase，hlcs）的肝特异性缺失抑制所有生物素依赖性羧化，并导致肝脏mRNA、蛋白质、翻译后和代谢调控的广泛变化。Hlcs缺失通过抑制malonate和methylmalonate生成，抑制Acsf3^KO肝脏中的代谢缺陷。Acsf3和Hlcs双敲除小鼠维持线粒体lipoylation，表明线粒体malonyl-CoA的生成高度冗余。这些数据定义了Acsf3在malonate和methylmalonate代谢编辑中的作用，以在面临内源性产生的抗代谢物时维持线粒体代谢。

研究背景：生物素（biotin，B7）是水溶性维生素，是中央碳代谢中多种羧化酶（carboxylase）的辅因子，在细胞质或线粒体基质中固定CO₂。全羧化酶合成酶（Holocarboxylase Synthetase，hlcs）以ATP依赖方式将生物素连接到细胞质和线粒体羧化酶；其先天性错误导致多种羧化酶缺陷。生物素依赖羧化产生malonyl-CoA，是脂肪酸生物化学中的核心代谢物。真核生物有两条脂肪酸合成途径：胞质乙酰-CoA羧化酶（Acetyl-CoA Carboxylase，ACC）起始途径和线粒体基质途径，后者类似原核脂肪酸合成，生成中链脂肪酸并最终生成α-lipoic acid（α-硫辛酸），加载到需要该辅因子的酶上。线粒体途径由malonyl-CoA装载到酰基载体蛋白（acyl-carrier protein，ACP）起始，但哺乳动物线粒体malonyl-CoA来源未明。ACSF3是线粒体malonyl-CoA synthetase，可ATP依赖地将CoA连接到malonate和methylmalonate。人类ACSF3突变导致合并丙二酸和甲基丙二酸尿症（Combined Malonic and Methylmalonic Aciduria，CMAMMA），表现发育迟缓、癫痫、低血糖、心肌病，但表型不完全外显，部分null突变个体呈轻或良性表现。malonate和methylmalonate是琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）竞争性抑制剂和三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环毒物。因此需要明确Acsf3在哺乳动物代谢、生物素羧化与线粒体malonyl-CoA生成中的作用。研究人员构建Acsf3敲除小鼠、肝特异性Hlcs缺失小鼠及双敲除小鼠。结论是：Acsf3缺失导致malonate和methylmalonate升高并出现线粒体代谢缺陷，但小鼠大体健康，类似人类先天性错误；Acsf3^KO保留malonyl-CoA synthetase活性冗余，提示疾病严重度存在遗传修饰。肝Hlcs缺失抑制生物素依赖羧化，导致mRNA、蛋白、翻译后和代谢调控广泛变化，并通过抑制malonate和methylmalonate生成抑制Acsf3^KO肝代谢缺陷。双敲除维持线粒体lipoylation，表明线粒体malonyl-CoA生成高度冗余。该研究意义在于定义Acsf3在代谢编辑中解毒内源抗代谢物、维持线粒体代谢的作用。

关键技术方法（≤250字）：研究人员使用AAV8-TBG-iCre或eGFP在5周龄Hlcs^f/f小鼠中诱导肝特异性hlcs敲除，Hlcs floxed小鼠来自Jackson labs（Jax #035494）并与R26-CreERT2交叉。Acsf3^-/-小鼠通过Crispr/Cas9在保守AMP结合域初始酪氨酸处引入终止密码子构建。将Hlcs^f/f与Acsf3^-/-交叉，经AAV8-TBG-iCre获得肝特异性Hlcs和全身Acsf3双敲除。主要技术包括Western blot、RT-qPCR、RNA-seq、TMT蛋白质组学、代谢组学（CE-FTMS）、酰基肉碱定量和血清代谢物测定。无人类样本队列，样本为小鼠模型。

研究结果：
1. 肝特异性急性缺失hlcs可被耐受（The acute liver specific loss of hlcs is tolerated）。通过AAV8-TBG-iCre在Hlcs^f/f小鼠中肝特异性敲除hlcs，在4小时fed和24小时fasted状态收集样本。结果hlcs mRNA丢失、生物素化羧化酶缺失，但氧化磷酸化复合物丰度、DLAT/DLST lipoylation、肝形态、体重、肝重、血糖、酮体、甘油三酯和甘油无明显变化，仅血清胆固醇轻度抑制。结论：与单细胞生物不同，哺乳动物肝脏不需要细胞自主生物素羧化经线粒体脂肪酸合成生成lipoic acid。
2. HLCS缺陷肝脏的蛋白质组学和转录组学鉴定出去 novo脂肪生成程序失调（Proteomics and transcriptomics of HLCS-deficient livers identify a dysregulated program for de-novo lipogenesis）。通过24小时fasted肝TMT蛋白质组学、Coomassie染色、Western blot和RNA-seq，发现Acly、Fasn、Scd1、G6pdx等de novo脂肪酸合成蛋白上调，Fasn蛋白上调显著；fed和fasted比较显示这些蛋白在fed状态诱导更强；Hlcs缺失降低生物素化羧化酶，fasting加剧，但不影响DLAT/DLST lipoylation。RNA-seq显示SREBP1靶基因Scd1、Fabp5、Acss2升高，Gdf15升高；KEGG分析显示脂肪酸生物合成基因诱导、氧化代谢相关基因抑制，但Fasn、Srebp、Acly mRNA与蛋白变化不一致。结论：肝生物素羧化缺失导致de novo脂肪生成程序失调，涉及转录和转录后调控。
3. ACSF3^KO小鼠重现CMAMMA（ACSF3 KO mice recapitulate Combined Malonic and Methylmalonic Aciduria）。通过Crispr/Cas9在保守AMP结合域初始酪氨酸处引入终止密码子，Acsf3 mRNA和蛋白缺失，血清和肝malonate和methylmalonate升高，NEFA和酮体正常，fed状态甘油三酯升高、胆固醇降低。结论：Acsf3^KO小鼠复制CMAMMA生化表型且大体正常。
4. ACSF3非依赖性malonate和methylmalonate代谢（ACSF3 independent malonate and methylmalonate metabolism）。通过肝酰基肉碱谱分析，Acsf3^KO中methylmalonyl-carnitine和malonyl-carnitine显著升高，而Hlcs^iCre中这些代谢物降低。结论：Acsf3缺失时存在替代途径激活malonate和methylmalonate。
5. Hlcs缺失抑制Acsf3介导的线粒体毒性（The loss of Hlcs suppresses Acsf3-mediated mitochondrial toxicity）。通过构建肝特异性Hlcs和Acsf3双敲除，RT-qPCR、Western blot、血清指标和代谢组分析显示，双敲除中Hlcs和Acsf3 mRNA类似单敲除，生物素化羧化酶降低，Acsf3蛋白丢失；循环酮体和甘油三酯变化少，NEFA略降，胆固醇抑制。肝中生成malonyl-CoA的ACC1、ACC2和ACSF3均缺失。Acss2和Fasn水平类似Hlcs单敲除；Acly降低，Scd1增加；malonylation类似Hlcs单敲除；lipoylation不变。mRNA和蛋白不一致提示翻译后调控。代谢组PCA显示Acsf3单敲除偏离WT最大，双敲除更接近Hlcs单敲除和WT；Acsf3^KO肝类似线粒体不足，FBP、GAP、DHAP增加，citrate和α-KG降低，双敲除糖酵解中间物恢复WT。结论：Hlcs缺失通过抑制malonate和methylmalonate生成减轻Acsf3缺失毒性，Acsf3在代谢编辑中解毒TCA循环毒物。

讨论部分总结：ACSF3属于acyl-CoA synthetase家族，在Arabidopsis中被去孤儿化为malonyl-CoA synthetase，人类突变导致CMAMMA。人群筛查显示该表型不完全外显，提示环境或遗传修饰。小鼠Acsf3缺失不致死，但体外研究提示其缺失抑制线粒体功能；肝代谢组提示malonate和methylmalonate抑制TCA循环，但小鼠无预期表型。malonyl-carnitine和methylmalonyl-carnitine升高提示短链acyl-CoA synthetases存在冗余，可能是人类CMAMMA表型差异的遗传修饰因素。哺乳动物有两种脂肪酸合成模式，Acsf3支持线粒体脂肪酸合成但并非必需；人鼠表型不像线粒体脂肪酸合成缺陷，敲除细胞也无lipoylation缺陷。酵母线粒体malonyl-CoA由线粒体基质ACC生成，哺乳动物ACC1/2双敲除消除脂肪酸合成和延长但不影响线粒体脂肪酸合成；本研究中Hlcs肝敲除及Hlcs和Acsf3双敲除证明这五种酶不需要细胞自主线粒体脂肪酸合成，线粒体malonyl-CoA生成高度冗余。Hlcs缺失抑制malonyl-CoA和methylmalonyl-CoA生成，减少Acsf3需求，抑制Acsf3^KO线粒体病征。Hlcs肝缺失类似ACC1/2双敲除，诱导de novo脂肪酸合成蛋白，mRNA和蛋白差异提示翻译后调控；Hlcs缺失诱导赖氨酸malonylation和propionylation相反变化。研究结论翻译：这些数据定义了Acsf3在malonate和methylmalonate代谢编辑中的作用，以在面临内源性产生的抗代谢物时维持线粒体代谢。在此，研究人员构建了体内模型以理解Acsf3在机体代谢稳态中的作用。与人类Acsf3先天性错误相似，小鼠敲除经历显著代谢表型但可维持生理稳态。通过敲除生物素连接酶hlcs而缺失生物素羧化可抑制代谢表型，清楚地将Acsf3置于代谢编辑中。Acsf3或Hlcs单独或联合均非线粒体脂肪酸合成所必需，指向这一古老途径的高度冗余。