TRIM8 RING E3连接酶通过非经典天冬酰胺linchpin残基实现对UBE2N介导的K63连接泛素化的结构选择性

《Journal of Biological Chemistry》：RING E3 ligase TRIM8 is structurally selective for UBE2N-mediated ubiquitination

　　

RING结构域通过稳定E2-泛素（ubiquitin, Ub）缀合物的闭合构象（closed conformation）催化泛素化（ubiquitination），其中三分基序（TRIpartite Motif, TRIM）蛋白是RING型E3连接酶（RING-type E3 ligase）最大的亚家族。TRIM蛋白参与许多生理过程和疾病。例如，TRIM8扰动（perturbation）以多种方式与神经发育缺陷和几种癌症类型相关联，这被归因于其对大量假定底物（putative substrates）的泛素化。然而，这些修饰背后的分子机制尚不清楚。在此，研究人员表明，TRIM8与E2酶UBE2N具有优先功能性，以生成K63连接的多聚泛素链（K63-linked poly-ubiquitin chains）。通过解析TRIM8 RING与UBE2N-Ub缀合物结合的晶体结构，研究人员发现，其非经典天冬酰胺（asparagine）‘linchpin’残基未能形成稳定其他E2酶闭合构象所需的关键接触，从而决定了这种选择性。这些发现不仅为探索TRIM8介导的K63链形成在健康和疾病中的影响打开了大门，而且增加了对RING结构域催化活性特异性的不断认识。

研究人员围绕RING型E3连接酶（RING-type E3 ligase）如何选择E2酶（ubiquitin-conjugating enzyme, E2）并决定泛素链连接类型这一问题展开。TRIM（TRIpartite Motif，三分基序）家族由76个成员组成，保守结构包括RING、1个或2个B-box和coiled-coil结构域，C端结构域差异决定其分为12个亚类。RING域通常被认为赋予泛素E3连接酶活性，但近期研究显示其存在E2偏好和催化失活“pseudoligase”RING域等复杂性。E2偏好对RING介导催化尤为重要，因为E2决定生成的泛素链连接类型。RING二聚化形成四螺旋束，稳定E2-Ub闭合催化构象，使泛素转移至底物赖氨酸。已有TRIM RING/E2-Ub结构中linchpin残基多为精氨酸，但66个含RING的TRIM蛋白中有30个（45%）使用替代linchpin残基，其结构机制未知。TRIM8属V类TRIM，linchpin为天冬酰胺，与健康脑发育、儿童脑病、胶质母细胞瘤等有关，并被认为泛素化TAK1、MYOF、HNF1α、PIAS3/STAT3轴及TRIM21等底物，但关于其生成K48或K63链的报道不一，机制不清。因此，研究人员针对TRIM8的E3连接酶催化特性开展研究。

研究人员通过E2筛选、体外泛素化、晶体结构、NMR和突变分析发现，TRIM8 RING优先与UBE2N/V1和UBE2N/V2功能，生成K63连接多聚泛素链；其非经典天冬酰胺linchpin残基N56仅接触泛素而不接触E2，不能有效稳定其他E2如UBE2D家族的闭合构象；N56R突变可使TRIM8获得对UBE2D1的活性。该研究揭示了TRIM8对UBE2N介导K63连接泛素化的结构选择性，提示TRIM8介导的K63链形成在健康和疾病中的潜在意义，并拓展了对RING域催化特异性的认识。

关键方法方面，研究人员使用E2scan筛查全部泛素E2，确定TRIM8 RING的E2偏好；开展体外泛素化及UbATTO、CY5标记泛素放电实验；用SEC-MALLS和CD评估寡聚状态与结构完整性；用2D ¹H-¹⁵N-HSQC NMR分析E2-Ub构象和相互作用；解析TRIM8 RING与UBE2N-Ub晶体结构，分辨率为2.4 ?，空间群P 1 2₁ 1；用AlphaFold3预测复合物，并用FoldSeek和BLAST分析结构及序列保守性。该研究未涉及临床样本队列，蛋白为重组表达，泛素为商业牛红细胞来源。

在“TRIM8 ubiquitin E3 ligase activity is selective for UBE2N to generate K63-linked ubiquitin chains（TRIM8泛素E3连接酶活性选择性作用于UBE2N以生成K63连接泛素链）”中，E2scan显示TRIM8 RING显著偏好UBE2N/V1和UBE2N/V2，荧光泛素实验确认该偏好；与高度混杂的UBE2D家族仅有微弱反应，且远低于阳性对照TRIM21。因此，TRIM8 RING显著偏好与合成K63连接多聚泛素链的UBE2N/V1和UBE2N/V2功能。

在“TRIM8 RING favours a monomeric state in solution（TRIM8 RING在溶液中倾向单体状态）”中，研究人员解析了TRIM8 RING与UBE2N-Ub复合物晶体结构，每个不对称单元含4拷贝分子。TRIM8 RING二聚体由α1和α3螺旋疏水界面介导，但α1顶部不对称弯曲，可能与N端大色氨酸侧链有关。SEC-MALLS显示溶液中存在单体:二聚体平衡；2D ¹H-¹⁵N-HSQC NMR仅显示约40个交叉峰，提示单体与二聚体间化学交换导致谱线增宽。FoldSeek搜索显示TRIM25 RING结构最相似。RING-RING串联构建体可加速UBE2N/V2的泛素链形成，并增加UBE2D1的二泛素产生，但未显著提高UBE2D1活性至TRIM21水平。因此，TRIM8 E2选择性并非由寡聚状态驱动。

在“TRIM8 RING has extensive interactions with ubiquitin but limited E2 contacts（TRIM8 RING与泛素广泛互作但与E2接触有限）”中，结构显示TRIM8 RING通过E12、N73和E76与泛素K11和K33形成离子串，保守H32接触泛素G35主链，N56接触泛素Q40侧链和R72主链。TRIM8 RING与UBE2N接触较少：L19主链羰基与UBE2N K10侧链氢键，P16、I17和P53与UBE2N P97和A98形成疏水斑块，E11在一个RING单体中与UBE2N R14形成离子相互作用；N56距E2最近原子超过6 ?。突变E12R和N56A几乎完全抑制泛素链形成，E76A仅轻微降低活性，三突变完全消除活性，CD确认突变体结构完整。因此，这些残基介导TRIM8 RING与泛素的相互作用，以催化UBE2N释放泛素。

在“Role of the ‘linchpin’ residue in dictating TRIM RING:E2 interactions（‘linchpin’残基在决定TRIM RING:E2互作中的作用）”中，TRIM8 N56仅接触E2-Ub中的泛素，不接触E2，而既往TRIM RING/E2-Ub结构中的精氨酸linchpin同时接触泛素和E2。结构预测显示N56R可使残基靠近UBE2N Q92或UBE2D1 K94主链。UBE2N-Ub倾向闭合构象，UBE2D家族倾向开放并需RING E3稳定闭合。TRIM8 N56R可在UBE2D1存在下促进泛素放电和泛素化，表明其更能稳定E2-Ub闭合态。NMR显示WT TRIM8可与UBE2D3结合，但WT对UBE2D1-Ub闭合构象稳定较弱，N56R使I44交叉峰消失；WT和N56R均可稳定UBE2N-Ub闭合构象。TRIM8 RING在后生动物中高度保守，包括天冬酰胺linchpin。因此，TRIM8因其非经典天冬酰胺linchpin不能稳定其他E2闭合构象，而优先以UBE2N生成K63连接泛素链。

讨论部分指出，解析E3连接酶特异性机制对理解生理功能及病理后果至关重要，而多数RING域如何选择E2以生成特定泛素链连接仍不清楚。该研究揭示TRIM8偏好生成K63连接泛素链，为理解其失调导致神经发育缺陷和脑癌提供了第一步。偏离精氨酸linchpin会影响RING活性：RNF38 linchpin突变中精氨酸对UBE2D2介导泛素化至少比其他残基有效3倍；FANCL:UBE2T中丝氨酸linchpin可配位水分子辅助E2结合；TRIM32虽有丝氨酸linchpin结构，但如何与泛素接触未知。两个天冬酰胺linchpin RING/E2-Ub结构TRAF6和RNF20/Bre1与TRIM8排列不同；Bre1可在过氧化物应激后以K63链修饰多核糖体，但UBE2A/B对TRIM8无活性，Bre1 N687A不完全消除活性。功能上，TRIM8介导的K63泛素化被报道调控PGK1和TAK1，但二者位于核外，与TRIM8核定位不一致；MDM2和PIAS3为核内候选，但是否直接靶标及链型尚需明确。临床上，TRIM8在胶质母细胞瘤中频发杂合性缺失，cProSite数据库报告TRIM8和UBE2N在脑癌中下调，需明确TRIM8/UBE2N K63泛素化底物以寻找治疗靶点。研究结论部分可翻译为：总之，这些发现表明，TRIM8已从后生动物中的TRIM家族进化出来，专一化利用UBE2N生成K63连接泛素链；本文所示结果为通过理解TRIM8专门的泛素E3连接酶活性来开始阐明TRIM8功能提供了宝贵机会。上述工作由Jane Dudley-Fraser、Diego Esposito和Katrin Rittinger完成。