KCNMA1基因BK钾通道Liang-Wang综合征相关新变异破坏通道转运与门控及NS11021的逆转作用

《Journal of Biological Chemistry》：Liang-Wang syndrome-associated variants in the BK potassium channel KCNMA1 disrupt channel trafficking and gating

　　

Liang-Wang综合征（Liang-Wang syndrome）是一种神经发育综合征（neurodevelopmental syndrome），以发育迟缓（developmental delay，DD）和智力障碍（intellectual disability，ID）为特征，并伴有多器官异常，其病因为KCNMA1编码的BK钾通道（BK potassium channel）的致病性变异（pathogenic variants）。在本研究中，研究人员利用宏观和单通道膜片钳记录（patch-clamping recordings），识别并表征了三个新的KCNMA1变异，包括p.W268R、p.A664T和p.M578T，以探讨其参与Liang-Wang综合征发病的分子机制。研究人员还评估了BK通道激活剂（BK channel activator）NS11021对这三个变异的影响。这三个变异均通过功能丧失机制（loss-of-function mechanism，LOF）发挥作用，均通过使G-V曲线（conductance-voltage curve）向更正的电位移动、增加激活时间常数并降低单通道开放概率（single channel open probability）而显著降低宏观BK电流密度（macroscopic BK current densities）。然而，其详细机制不同。变异p.W268R降低BK通道向膜的转运（trafficking），并降低钙（Ca²⁺）和镁（Mg²⁺）敏感性；p.A664T降低单通道开放停留时间（open dwell time），降低钙敏感性但增加镁敏感性；p.M578T降低单通道开放停留时间，并降低钙和镁敏感性。值得注意的是，NS11021逆转了与三个KCNMA1变异相关的电生理异常。总之，研究人员的结果为遗传检测（genetic testing）和遗传咨询（genetic counseling）提供了重要信息，并表明小分子化合物（small molecule compound）NS11021逆转与三个Liang-Wang综合征变异相关的细胞异常，提示一种候选治疗策略（candidate therapeutic strategy）。

Liang-Wang综合征（Liang-Wang syndrome）是由KCNMA1致病性变异引起的神经发育综合征，以发育迟缓（developmental delay，DD）和智力障碍（intellectual disability，ID）为核心，伴多器官异常。KCNMA1编码BK钾通道（large conductance voltage- and calcium-activated K⁺ channel，BK）α亚基；该通道由四个α亚基构成同源四聚体，并与β1–4、γ1–γ4及LINGO1/2等调节亚基组合。α亚基含胞外N端、S0–S6七次跨膜段和长胞内C端，C端含RCK1、RCK2及Ca²⁺结合位点；S1–S4构成电压感受域，S4为电压传感螺旋，S5–S6构成孔道域。2005年研究人员以定位克隆发现KCNMA1 p.D434G功能获得（gain-of-function，GOF）变异导致全面性癫痫伴发作性运动障碍；2018年报道p.N995S GOF，2020年Zhang et al.报道p.N536H GOF。2019年研究人员报道8个LOF变异导致Liang-Wang综合征，OMIM: 618729；此后Du et al.、Yao et al.及研究人员又报道多个LOF变异。临床高度异质，除DD/ID外可见共济失调、癫痫、语言延迟、生长迟缓、面部异常、内脏畸形、眼/听力损害、牙齿异常、胃消化问题、脑MRI异常、新生儿糖尿病等，部分患者早死。目前无有效治疗。NS11021为BK通道激活剂，作用于孔道，可增强K⁺占据并开放选择过滤门，不依赖Ca²⁺左移G-V曲线并增加开放概率。因Liang-Wang综合征变异多为LOF，研究人员提出NS11021可能用于治疗该病。

本研究识别并表征四个KCNMA1变异：三个致病p.W268R、p.M578T、p.A664T和一个良性p.D731E。通过临床表型、电生理和生化分析，扩展基因型表型谱，为遗传检测和遗传咨询提供信息，并发现NS11021逆转三个致病变异电生理异常，提示候选治疗策略。其意义在于强调功能表征区分功能性与良性变异的重要性。

关键技术方法：本研究的样本队列为4例携带KCNMA1变异的患者/家系，均经商业遗传检测发现，患者或家庭向遗传咨询师/医生咨询后与研究人员沟通；研究经华中科技大学等伦理委员会批准，为回顾性研究，豁免个体知情同意，资料匿名化。主要技术包括整理临床表型；将FLAG标记的野生型及患者相关KCNMA1变异质粒在tsA-201人源胚胎肾细胞中表达；采用宏观和单通道膜片钳记录BK电流；分离总蛋白和膜蛋白进行Western blot，评估表达与膜转运；按ACMG指南分类变异；用t检验、单因素/双因素ANOVA及Dunnett/Bonferroni校正进行统计。

研究结果：

1. 与Liang-Wang综合征相关的KCNMA1变异p.W268R的鉴定及其分子机制
在土耳其4岁男性发现杂合c.802T>C [p.W268R]（NM_002247.3）。临床有神经运动发育迟缓、自限性癫痫发作、肌张力低下、MRI异常、吞咽困难需鼻胃管。父母未测序，是否de novo未知。W268位于S4段，进化保守，多软件预测有害。将WT、突变及WT+突变1:1表达于tsA-201细胞并行膜片钳。p.W268R同源和杂合均显著降低宏观BK电流，杂合约WT的50%；10 μM Ca²⁺下G-V右移+42 mV（同源）和+23 mV（杂合）；活化时间常数分别增加约500%–900%和300%–500%。钙敏感性：同源在0、1、10 μM Ca²⁺右移+25、+39、+42 mV，杂合右移+21、+19、+23 mV，V_1/2略升；同源低Ca²⁺钙反应降低。镁敏感性：0、10 mM Mg²⁺右移+35、+37 mV，V_1/2增加，同源镁反应降低。单通道：开放概率降低，Po-V在1、10 μM Ca²⁺右移+23、+33 mV，单通道电导无显著差异，开放停留时间常数相近。Western blot显示膜组分突变蛋白显著减少。结论：LOF，因降低单通道开放概率、增加活化时间常数和减少膜转运而降低宏观电流。

2. 与Liang-Wang综合征相关的KCNMA1变异p.M578T的鉴定及其分子机制
在波兰15岁女性发现杂合c.1733T>C [p.M578T]，de novo。临床有认知损害、全面发育迟缓、智力残疾、言语语言发育延迟、消化问题、癫痫发作/癫痫、自闭症、攻击行为、行为异常、EEG异常和肥胖。M578位于RCK1，Ca²⁺高亲和结合域，进化保守，预测有害。膜片钳显示同源和杂合均降低宏观电流，杂合约降20%，同源约降65%；10 μM Ca²⁺下G-V右移+21 mV（杂合）和+75 mV（同源）；活化时间常数增加约50%和150%。钙敏感性：同源在0、1、10 μM Ca²⁺右移+35、+8、+75 mV，V_1/2在0、1 μM降低、10 μM升高；杂合在0 μM左移-11 mV，在1、10 μM右移+4、+21 mV。0→1 μM Ca²⁺时WT G-V左移-20 mV，而p.M578T右移+7 mV，提示钙敏感性丢失和Ca²⁺调制方向反转；同源钙敏感性由108 mV降至27 mV，杂合降至93 mV。镁敏感性：同源0、10 mM Mg²⁺右移+35、+8 mV，V_1/2降低，镁敏感性降低。单通道：1 μM Ca²⁺开放概率显著增加，10 μM显著降低；电导无差异；Po-V在10 μM右移+54 mV，在1 μM左移-29 mV；开放时间常数在1 μM增加但不显著，10 μM显著降低。Western blot总/膜表达无差异。结论：LOF，M578可能是BK通道“钙开关”，该变异在低Ca²⁺消除钙敏感性并反转G-V移动模式。

3. 与Liang-Wang综合征相关的KCNMA1变异p.A664T的鉴定及其分子机制
在6岁男性发现de novo杂合c.1990G>A [p.A664T]。临床有发育迟缓（尤言语）、肛瘘、社交互动受损和刻板行为，诊断自闭症谱系障碍。A664位于RCK1，进化保守，预测有害。膜片钳显示同源和杂合均降低宏观电流；10 μM Ca²⁺下G-V右移+23 mV（杂合）和+45 mV（同源）；活化时间常数增加约30%和100%。钙敏感性：杂合在0、1、10 μM Ca²⁺右移+6、+14、+23 mV，同源右移+27、+23、+45 mV，V_1/2略高，钙敏感性降低。镁敏感性：0、10 mM Mg²⁺下G-V右移，V_1/2增加，镁敏感性增加。单通道：1、10 μM Ca²⁺开放概率显著降低，电导无差异，Po-V右移+33、+24 mV，开放时间常数显著降低。Western blot总/膜表达无差异。结论：LOF，通过降低单通道开放概率和开放停留时间降低宏观电流。

4. KCNMA1变异p.D731E为良性变异
在5岁男性发现de novo杂合c.2193C>A [p.D731E]，临床有发育迟缓和自闭行为。该残基位于RCK1与RCK2之间且进化保守，软件预测非有害。膜片钳未检测到WT与p.D731E通道显著差异。结论：良性。

5. 按ACMG指南对KCNMA1变异分类
四个新变异中，p.W268R位于S4电压感受器，满足PS3、PM1、PM2、PP3，为可能致病；p.M578T位于RCK1，满足PS2、PS3、PM1、PM2、PP3、PP4，为致病；p.A664T位于RCK1，满足PS2、PS3_mod、PM2_sup、PP2、PP3、PP4，为致病；p.D731E为可能良性，不引起Liang-Wang综合征。

6. NS11021逆转三个突变BK通道的电生理异常
对WT/p.W268R，3或10 μM NS11021恢复电流至WT水平，G-V左移，V_1/2降低；对同源p.W268R不增强电流。对WT/p.M578T和WT/p.A664T，3或10 μM NS11021恢复电流至WT水平，G-V左移，V_1/2降低；NS11021轻微增强同源p.M578T电流，10 μM恢复同源p.A664T电流至WT。单通道中，3 μM NS11021显著增加三个突变通道开放概率并延长开放停留时间。与WT相比，p.W268R、p.M578T、p.A664T的开放概率均降低，Po-V右移+34、+57、+29 mV；3 μM NS11021恢复p.W268R和p.A664T开放概率至WT，但不能恢复p.M578T。p.M578T和p.A664T显著缩短开放停留时间，p.W268R无；NS11021部分逆转p.M578T缩短，p.W268R和p.A664T在NS11021下开放停留时间更长。结论：NS11021可逆转三个LOF变体电生理异常。

讨论总结：原文讨论指出，尽管对BK通道致病变异关注增加，临床表型与基因型关联仍有限。本研究描述四个变异功能和生物物理特征，扩展Liang-Wang综合征基因型表型谱。三个致病变异共享DD/ID；p.W268R附加肌张力低、癫痫、MRI异常、吞咽困难；p.M578T附加语言延迟、癫痫、消化问题、自闭症、攻击行为、EEG异常和肥胖；p.A664T附加ASD社交受损、刻板行为和肛瘘。p.W268R为首个S4跨膜域Liang-Wang综合征变异；S4正电荷精氨酸残基对BK功能重要，增加一个正电荷精氨酸未改善功能反而有害。p.M578T和p.A664T位于RCK1，既往多个致病。三个变异降低宏观电流但机制相似又不同，可能解释表型变异，但每变异仅单患者，需更多患者。p.M578T数据支持M578为“钙开关”；既往M578I降低Ca²⁺敏感性支持；D432和E600可能直接结合Ca²⁺，M578侧链在无Ca²⁺时朝向结合口袋。三个变异对镁敏感性影响不同，可能贡献外显降低/表达变异。本研究首次用单通道记录功能表征Liang-Wang综合征变异，强调电生理表征区分因果变异重要，有助精准医学。RCK1和RCK2两个Ca²⁺结合位点独立/均等贡献，协同小；M578I和RCK2突变降低钙敏感性但不消除，双突变几乎无反应。本研究单突变M578T切换G-V移动模式。斜率因子：p.W268R S4突变斜率降低，其他增加，提示更电压敏感且与S4额外正电荷一致；但电流正移。基于Horrigan-Aldrich模型，斜率与电压感受器总电荷有关，V_1/2正移与斜率降低矛盾提示耦合因子或D因子改变；D代表电压传感器转换为开放能量效率，D降低可右移V_1/2。W268在S4可能稳定VSD与孔道界面；cryo-EM显示S4邻近S5和孔道连接，p.W268R可能破坏结构、降低D因子。其他两个位于钙敏感域可能影响E耦合因子。宏观与单通道斜率因子相反，因宏观G=N×P_o×i，受功能膜通道数和记录混杂影响；单通道Po-V隔离门控电压依赖，独立表达密度；W268R膜转运改变可造成差异。Liang-Wang综合征严重且无有效治疗，许多患者仅抗癫痫缓解有限；NS11021在<10 μM、杂合状态模拟患者时逆转三个变异电生理缺陷。局限性：NS11021研究仅在tsA-201过表达α亚基，天然组织有β/γ亚基调节Ca²⁺/电压敏感性和药物反应；β亚基可改变药物敏感性，如GoSlo-SR-5-130与β1或β4共表达效力增加3倍，G-V左移70 mV；未来需共表达β/γ。救援仅为简化系统细胞电生理，需iPSC分化神经元、原代神经元或动物模型验证。等质量WT和突变共转染不能确保等蛋白丰度或WT/突变四聚体分布，尤其W268R膜丰度降低。

结论翻译：在本研究中，研究人员识别并表征了四个新的KCNMA1变异，包括三个与Liang-Wang综合征相关的致病性变异（p.W268R、p.M578T和p.A664T）以及一个良性变异。数据强调了对所有已鉴定KCNMA1变异进行功能表征以区分功能性变异或良性变异的关键重要性。此类信息对遗传检测和遗传咨询至关重要。三个致病性变异通过降低宏观BK电流的LOF机制发挥作用。其潜在机制有一些相似性，但在某些细节上不同。研究人员发现NS11021逆转三个突变BK通道（p.W268R、p.M578T和p.A664T）的电生理异常。这些数据扩展了KCNMA1变异范围及与KCNMA1变异相关的临床特征，并为Liang-Wang综合征提供了潜在治疗选择。