ERK介导的磷酸化调控半胱氨酸蛋白酶CAPN3的自溶加工过程

《Journal of Biological Chemistry》：ERK-mediated phosphorylation modulates the autolytic processing of the cysteine protease CAPN3

　　

论文摘要翻译 Calpain-3（CAPN3）是一种主要表达于骨骼肌中的Ca2+依赖性半胱氨酸蛋白酶。CAPN3基因突变与肢带型肌营养不良R1型（LGMDR1）相关，这是一种常染色体隐性遗传性肌营养不良症。CAPN3的独特之处在于其通过快速自溶加工被激活；然而，调控这一激活过程的机制目前尚不清楚。本研究显示，磷酸化在活细胞中调控CAPN3的自溶加工。研究人员发现，强心苷类药物哇巴因（ouabain）可激活ERK，进而诱导CAPN3位于其N端区域内的S19位点发生磷酸化。该磷酸化促进了N端切割，但不改变CAPN3的自溶插入序列1（IS1）加工过程，也不影响其在骨骼肌细胞中的亚细胞定位。值得注意的是，用胰岛素样生长因子I（IGF-I）处理培养的骨骼肌细胞（IGF-I可激活ERK通路）同样可诱导S19磷酸化，提示该修饰可发生在生理相关的细胞外信号下游。上述结果表明，ERK介导的磷酸化为调控CAPN3的N端加工提供了一种调节机制，且不会显著影响IS1自溶加工。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

Calpain家族是一类Ca²⁺依赖性半胱氨酸蛋白酶，通过有限蛋白水解作用调控细胞骨架重塑、细胞分化、迁移和凋亡等多种生物学过程。在已发现的15种人类calpain中，calpain-3（CAPN3/p94）是主要表达于骨骼肌的经典calpain成员。CAPN3基因突变可导致肢带型肌营养不良R1型（LGMDR1），这是一种常染色体隐性遗传性肌营养不良症，因此阐明CAPN3的激活机制及其在骨骼肌中的生理功能具有重要的临床意义。

经典calpain成员calpain-1和calpain-2的Ca²⁺依赖性激活机制已被广泛研究，二者以异二聚体形式存在，由80-kDa大催化亚基和30-kDa调节亚基组成。在无Ca²⁺条件下，calpain-2形成扁平椭圆盘状结构，N端锚定螺旋的位置限制了催化三联体残基的组装，使酶处于非活性状态；当Ca²⁺结合后，该螺旋施加的约束被解除，形成功能性催化裂隙，酶被激活。

CAPN3虽与经典calpain共享基本结构架构，但包含三个独特的插入序列：N端序列（NS）、PC2内的插入序列1（IS1）以及CBSW与PEF结构域之间的插入序列2（IS2）。IS1区域的自溶去除是CAPN3发挥完全酶活性的必要条件。与CAPN1和CAPN2需要胞质钙浓度显著升高才能激活不同，CAPN3在异源细胞中即使没有细胞外刺激也会发生自发激活，这种快速激活阻碍了针对全长蛋白Ca²⁺依赖性激活精确机制的结构研究，导致活细胞中调控CAPN3自溶的精确机制仍不清楚。

鉴于磷酸化可调控calpain家族多个成员，且哇巴因（ouabain）这一强心苷类药物既能诱导CAPN3激活（通过引起胞质Ca²⁺水平小幅持续升高），又能激活包括Ras/Raf/ERK在内的多种信号通路，研究人员提出如下科学问题：Ras/Raf/ERK通路信号是否可诱导CAPN3磷酸化并影响其在活细胞中的加工过程？

二、主要技术方法

研究人员综合运用了多种关键技术手段：采用Phos-tag SDS-PAGE凝胶电泳结合免疫印迹检测蛋白质磷酸化导致的迁移率变化；利用质谱分析（LC-MS/MS）鉴定CAPN3的具体磷酸化位点；构建多种CAPN3突变体（包括蛋白酶失活突变体CAPN3:CS、活性降低突变体CAPN3:S606L、磷酸化缺陷突变体S19A及磷酸化模拟突变体S19D）以及缺失突变体（ΔNS和ΔPEF）；通过体外激酶实验验证ERK对CAPN3 S19位点的直接磷酸化作用；使用自主研发的anti-phospho-S19特异性抗体进行磷酸化检测；利用来自CAPN3:CS敲入小鼠（CAPN3KI）的培养骨骼肌肌管进行内源性蛋白验证；通过腺相关病毒（AAV）介导的基因递送在CAPN3缺陷（Capn3^-/-）小鼠胫骨前肌中进行体内定位研究；并使用ERK抑制剂SCH772984验证ERK通路参与。

三、研究结果

哇巴因增加培养骨骼肌肌管中CAPN3的磷酸化

由于野生型CAPN3在异源细胞中因快速自溶而不稳定，研究人员使用蛋白酶失活突变体CAPN3:CS和活性降低突变体CAPN3:S606L进行检测。在HeLa细胞中，哇巴因刺激后Phos-tag SDS-PAGE上CAPN3的迁移率上移条带信号增强，表明发生磷酸化。在CAPN3KI小鼠来源的培养骨骼肌肌管中，哇巴因同样显著增加内源性CAPN3:CS的磷酸化条带。此外，组成性活化的Fyn（Src家族酪氨酸激酶成员，Fyn-YF）共表达可增加CAPN3:CS的磷酸化，且该效应在ΔPEF突变体中保留但在ΔNS突变体中完全消失，表明NS区域包含CAPN3磷酸化的主要位点。

ERK在S19位点磷酸化CAPN3

质谱分析鉴定出多个CAPN3磷酸化位点，其中包含phospho-S19的肽段检出频率最高，且Fyn-YF共表达显著增加含磷酸化S19肽段的比例。S19位于CAPN3的N端序列内，其周围序列符合ERK磷酸化共有基序（P-X-S/T-P），且S19在多种哺乳动物中高度保守。体外激酶实验证实重组ERK可直接磷酸化MBP-CAPN3:CS的S19位点。S19A突变完全消除了Fyn-YF诱导的Phos-tag迁移率位移，进一步证实S19是功能性磷酸化位点。ERK抑制剂SCH772984可降低哇巴因和Fyn-YF诱导的磷酸化信号。

S19磷酸化不影响小鼠骨骼肌中CAPN3的亚细胞定位

通过AAV载体将EGFP-CAPN3:S19A和磷酸化模拟突变体EGFP-CAPN3:S19D递送至Capn3^-/-小鼠胫骨前肌，免疫组化分析显示两种突变体与野生型CAPN3一样主要定位于肌节M带，表明S19磷酸化不显著影响CAPN3的体内亚细胞定位。

S19磷酸化选择性调控CAPN3的N端加工

在HEK293T细胞中比较野生型CAPN3、S19A和S19D突变体的自溶加工情况。IS1加工在三种蛋白间无显著差异，但S19A突变显著降低了片段a向片段b的转化（即N端加工），而S19D突变体与野生型无显著差异，表明S19磷酸化选择性促进N端加工而不显著影响IS1自溶。

IGF-1增加培养骨骼肌细胞中CAPN3的S19磷酸化

由于ERK可被多种细胞外信号激活，研究人员检测了IGF-1（肌肉生长和再生的关键调节因子）的作用。在CAPN3KI小鼠来源的培养肌管中，IGF-1处理15分钟显著增加S19磷酸化水平，表明该修饰可发生在生理相关的细胞外信号下游。

四、讨论与结论

本研究鉴定出S19为CAPN3的ERK依赖性磷酸化位点，并证明该磷酸化选择性调控N端加工而不显著改变IS1自溶。这一发现将磷酸化调控扩展至calpain家族的新成员，表明CAPN3内部不同的自溶加工事件可被差异性调控。S19A突变降低N端加工而IS1加工不受影响，鉴于IS1去除是CAPN3完全蛋白酶活性所需的关键步骤，S19磷酸化并不增加CAPN3的内在蛋白酶活性，而是选择性调控其N端区域的加工。N端加工的功能意义尚待阐明——在CAPN1和CAPN2中，N端区域去除与Ca²⁺敏感性改变相关，提示CAPN3的N端加工可能同样影响其酶学特性，但这一可能性在现有实验条件下难以评估。IGF-1可诱导S19磷酸化，表明CAPN3磷酸化不仅可由哇巴因等药理学刺激诱导，还可发生在激活ERK通路的生理相关细胞外信号下游。未来研究需确定S19磷酸化在体内骨骼肌中发生的时间和部位，以及其是否随肌肉收缩、损伤或再生而变化。本研究为探讨骨骼肌中N端加工的生理意义提供了基础。

研究结论：ERK介导的S19磷酸化为调控CAPN3自溶加工提供了一种新的调节机制，可选择性促进N端加工而不显著影响IS1自溶，揭示了CAPN3内部不同自溶加工事件可被差异性调控，为理解CAPN3在骨骼肌中的功能调控提供了新视角。