《Journal of Biological Chemistry》：ATG13 Recruits LC3 to Target H9N2-IAV PB1 for Autophagic-Lysosomal Degradation and Restricts Viral Replication
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自噬相关蛋白13（ATG13）是自噬起始复合物的关键组分，在调控自噬启动中发挥重要作用。然而，ATG13调控甲型流感病毒（IAV）复制的精确机制尚不清楚。本研究中，研究人员证明了ATG13特异性结合H9N2-IAV的病毒聚合酶碱性蛋白1（PB1），并促进PB1
自噬相关蛋白13（ATG13）是自噬起始复合物的关键组分，在调控自噬启动中发挥重要作用。然而，ATG13调控甲型流感病毒（IAV）复制的精确机制尚不清楚。本研究中，研究人员证明了ATG13特异性结合H9N2-IAV的病毒聚合酶碱性蛋白1（PB1），并促进PB1的自噬降解。机制上，ATG13靶向PB1的C端结构域，并招募微管相关蛋白1轻链3（LC3）促进PB1的自噬溶酶体降解。该过程拮抗PB1介导的线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）降解，从而削弱H9N2-IAV的免疫逃逸能力，最终抑制病毒复制。综上，研究结果首次揭示ATG13通过介导自噬溶酶体途径靶向降解PB1从而负调控IAV复制的分子机制。该研究揭示了自噬通路在宿主抗病毒防御中的新作用，并为抗流感药物提供了潜在治疗靶点。
**论文解读**
**一、研究背景与科学问题**
甲型流感病毒（Influenza A virus, IAV）为单股负链RNA病毒，其基因组编码至少12种病毒蛋白，其中聚合酶碱性蛋白1（polymerase basic protein 1, PB1）作为病毒核糖核蛋白（viral ribonucleoprotein, vRNP）复合物的核心催化亚基，在病毒转录与复制中发挥关键作用。H9N2亚型禽流感病毒（H9N2-IAV）作为低致病性禽流感病毒，可为H5、H7和H10等亚型病毒提供内部基因，通过基因重配产生新型威胁性流感病毒株。研究人员前期发现，H9N2-IAV的PB1蛋白可通过劫持宿主蛋白三基序蛋白25（tripartite motif 25, TRIM25）降解线粒体抗病毒信号蛋白（mitochondrial antiviral signaling protein, MAVS），从而抑制干扰素通路，实现免疫逃逸。然而，宿主如何对抗PB1介导的免疫逃逸尚不清楚。
自噬是真核细胞中通过溶酶体途径降解受损细胞器、错误折叠蛋白及细胞内病原体的核心降解与循环机制。自噬相关蛋白13（autophagy-related protein 13, ATG13）作为自噬起始复合物的关键组分，在营养充足时被磷酸化而抑制自噬，在营养缺乏或应激条件下去磷酸化促进自噬。既往研究提示ATG13对包括流感病毒在内的多种病毒复制具有抑制作用，但ATG13与IAV编码蛋白之间的直接关系及其精确分子机制仍不明确。因此，阐明ATG13如何通过自噬通路靶向病毒蛋白并限制IAV复制，具有重要的基础病毒学和抗病毒治疗意义。
**二、研究内容与总体结论**
本研究旨在揭示ATG13调控H9N2-IAV复制的分子机制。研究人员通过一系列生化与细胞生物学实验证明：ATG13特异性结合H9N2-IAV的PB1蛋白，并通过LC3依赖的自噬溶酶体途径促进PB1完全自噬降解；ATG13靶向PB1的C端结构域（aa 493–758），其自身的HORMA结构域和LC3互作区（LC3-interacting region, LIR）是降解PB1所必需；ATG13通过降解PB1逆转PB1介导的MAVS降解，从而阻断病毒免疫逃逸并最终抑制H9N2-IAV复制。该研究首次揭示ATG13作为干扰素非依赖的宿主限制因子，通过自噬通路靶向降解病毒蛋白抵御IAV感染的新机制，为抗流感药物研发提供了潜在靶点。
**三、主要关键技术方法**
研究使用HEK-293T、A549、MDCK及THP-1细胞系；H9N2-IAV毒株为A/chicken/Hong Kong/G9/1997，另含H1N1（PR8）、H7N9、H5N1、H6N6、H5N6等亚型PB1质粒。主要技术包括：共免疫沉淀（Co-IP）筛选与验证蛋白互作；免疫印迹检测蛋白表达水平；应用放线菌酮（CHX）追踪蛋白降解；应用3-甲基腺嘌呤（3-MA）、NH?Cl、MG132和Z-VAD-FMK（ZVAD）等抑制剂鉴定降解途径；GFP-mCherry-LC3串联荧光探针评估自噬流完整性；激光共聚焦显微镜检测蛋白共定位与自噬体形成；短发夹RNA（shRNA）和小干扰RNA（siRNA）敲低ATG13或LC3；体外转录-翻译pull-down实验验证PB1与LC3直接结合；TCID??法测定病毒滴度。
**四、研究结果**
**4.1 ATG13与H9N2-IAV PB1相互作用**
研究对H9N2-IAV的12种病毒蛋白进行Co-IP筛选，发现ATG13仅与PB1结合，而不与NP、HA、NA、NS1、NS2、M1、M2、PA、PAX、PB1-F2或PB2相互作用。半内源性和内源性Co-IP进一步验证ATG13与PB1在HEK-293T细胞及H9N2感染后均可结合；共聚焦显微镜显示二者在细胞质中共定位。结论：ATG13特异性结合H9N2-IAV PB1。
**4.2 ATG13促进PB1的自噬降解**
ATG13以剂量依赖方式降低H9N2-IAV PB1蛋白水平，且CHX存在下仍促进PB1降解，表明ATG13不影响PB1合成而直接促进其降解。ATG13对H1N1、H7N9、H5N1、H6N6和H5N6等多种亚型PB1均具有剂量依赖性降解作用，提示该机制具有广谱性。敲低ATG13则增加PB1水平而不影响NP。药理学抑制实验显示，早期自噬抑制剂3-MA和溶酶体抑制剂NH?Cl可逆转ATG13介导的PB1降解，而蛋白酶体抑制剂MG132和凋亡抑制剂ZVAD无效，证明ATG13通过自噬溶酶体途径降解PB1。进一步实验表明ATG13增加LC3-II表达并降低p62水平，增加LC3阳性自噬体数量；GFP-mCherry-LC3串联探针显示ATG13过表达导致GFP荧光减弱、mCherry荧光增强，表明ATG13促进PB1的完全自噬降解。
**4.3 ATG13识别并降解PB1的C端结构域**
通过构建PB1截短突变体，Co-IP实验显示ATG13与全长PB1及C端结构域（aa 493–758）结合；蛋白表达实验显示仅全长PB1和C端结构域被ATG13降解。结论：ATG13通过PB1的C端结构域识别并介导其降解。
**4.4 ATG13的HORMA结构域和LC3互作区对降解PB1至关重要**
ATG13的C端缺失突变体（ΔC）丧失与PB1的互作，说明ATG13 C端是结合PB1的关键区域。进一步对五个ATG13突变体（PLBD mut、HD mut、Δ348–373、LIR mut、ΔTLQ）进行检测，发现所有突变体仍能与PB1结合，但HORMA结构域突变体和LIR突变体丧失降解PB1的能力，表明ATG13与ATG101及LC3的互作对于PB1降解至关重要。
**4.5 ATG13通过LC3促进PB1的自噬溶酶体降解**
Co-IP显示PB1与LC3结合但不与ATG101结合；体外转录-翻译pull-down实验证实PB1与LC3存在直接结合。LC3以剂量依赖性方式降解PB1；敲低LC3显著削弱ATG13介导的PB1降解，证明LC3是ATG13降解PB1的关键效应分子。此外，PB1与经典自噬受体p62、NBR1、NDP52、OPTN和TOLLIP均无互作，表明该过程不依赖经典自噬受体货物途径。
**4.6 ATG13通过阻断病毒免疫逃逸抑制H9N2-IAV复制**
ATG13自身不影响MAVS表达，但剂量依赖性抑制H9N2-IAV PB1介导的外源性和内源性MAVS降解；敲低ATG13则加剧PB1诱导的MAVS降解。功能实验显示，ATG13过表达显著降低HEK-293T和A549细胞中的H9N2-IAV滴度；ATG13敲低的A549细胞和ATG13敲除的THP-1细胞中病毒滴度显著升高。在敲低ATG13的小鼠原代肺细胞和肾细胞中，H9N2-IAV复制显著增强，进一步验证ATG13在生理相关细胞中的抗病毒作用。
**五、讨论与结论总结**
讨论部分指出，宿主在长期共进化中发展出多种抗病毒防御机制，包括干扰素依赖和非依赖的宿主限制因子（HRFs）。本研究证实ATG13直接靶向并降解H9N2-IAV PB1，从而阻断病毒免疫逃逸并抑制病毒复制，鉴定ATG13为一种新型干扰素非依赖的宿主限制因子。与HACD3通过竞争p62保护PB1相反，ATG13促进PB1的自噬降解；而TRIM32则通过泛素-蛋白酶体途径降解PB1，体现宿主多重机制协同抗病毒。ATG13对多种IAV亚型PB1均具降解作用，提示广谱抗病毒潜力。机制上，ATG13结合PB1的C端结构域，其自身C端负责识别底物；ATG13的HORMA结构域与ATG101形成二聚体维持自噬启动功能，LIR基序则负责招募LC3，二者均为PB1降解所必需。PB1直接与LC3结合，且该过程不依赖经典自噬受体，提示LC3在清除特定病毒蛋白中承担直接货物识别功能。在免疫逃逸层面，ATG13逆转PB1介导的MAVS降解，恢复宿主固有免疫应答，从而抑制H9N2-IAV复制。
研究结论：本研究阐明ATG13通过LC3依赖的途径靶向H9N2-IAV PB1并介导其完全自噬降解的新机制。该过程有效逆转PB1介导的MAVS降解，拮抗H9N2-IAV逃避宿主固有免疫的能力，最终抑制病毒复制。这些发现显著提升了对宿主抵御IAV免疫逃逸策略的理解，为研发新型抗流感药物提供了有前景的治疗靶点和坚实的理论基础。
