MYCBP通过锚定Astrin/SKAP复合体于动粒确保有丝分裂染色体精确分离的机制

《Journal of Biological Chemistry》：MYCBP ensures faithful chromosome segregation during mitosis by anchoring Astrin/SKAP to kinetochore

　　

中文专业翻译摘要 正确的动粒-微管（kinetochore-microtubule, KT-MT）附着对于有丝分裂过程中染色体的精确分离至关重要。定位于外动粒的Astrin复合体能够稳定正确的KT-MT附着，从而确保准确的染色体排列与分离。MYCBP已被鉴定为Astrin复合体的一个亚基，但其在有丝分裂中的功能仍不清楚。本研究中，研究人员发现MYCBP在间期呈弥散的胞质和核分布，但在中期和后期则富集于纺锤体和动粒。在HeLa和HCT116细胞中敲低MYCBP导致中期排列缺陷、有丝分裂阻滞和后期间桥。MYCBP缺失并未改变总Astrin或SKAP蛋白水平，但显著降低了它们在动粒的定位，并损害了KT-MT附着的稳定性。MYCBP通过其N末端与Astrin/SKAP发生物理相互作用，并指定它们在动粒的定位。重要的是，通过膜通透性竞争肽或点突变破坏MYCBP-SKAP相互作用，会消除精确的染色体分离，重现了MYCBP敲低的表型。这些发现揭示了MYCBP-SKAP相互作用在实现稳定的动粒-微管互作中的关键作用，这对于忠实的染色体分离至关重要。

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研究背景与科学问题

在有丝分裂中，姐妹染色单体均等分离到两个子细胞依赖于正确双极附着的建立，即姐妹动粒与来自两极纺锤体微管之间的稳定连接。外动粒作为介导动粒-微管（kinetochore-microtubule, KT-MT）附着和纺锤体组装检验点的结构基础，其核心骨架是KMN网络复合体，其中NDC80复合体是介导KT-MT附着的核心蛋白。在酵母中，Dam1复合体可围绕微管形成环状高阶结构以增强附着稳定性；而在脊椎动物中，SKA1复合体被视为Dam1的功能同源物。值得注意的是，Astrin复合体是脊椎动物进化获得的一个额外KT-MT附着因子，它选择性地定位于已建立正确双极附着的动粒。Astrin复合体由Astrin、SKAP、LC8和MYCBP四个亚基以2:2:2:2的化学计量比组装而成。尽管MYCBP最初被鉴定为c-MYC转录共激活因子，并参与线粒体定位和Hedgehog信号调控等多种功能，但它作为Astrin复合体组分在有丝分裂中的精确角色仍不明确。因此，本研究旨在系统阐明MYCBP在KT-MT附着稳定性、染色体排列保真度和有丝分裂进程中的作用及其分子机制。

主要研究方法与技术

研究人员采用免疫荧光显微镜技术观察内源性MYCBP在不同细胞周期的亚细胞定位动态；利用RNA干扰技术在HeLa和HCT116细胞中进行基因敲低实验评估MYCBP功能；运用活细胞成像追踪有丝分裂进程；通过冷处理实验分析动粒微管（k-fiber）稳定性；借助AlphaFold3预测蛋白质结构并设计点突变体；采用免疫共沉淀验证蛋白相互作用；构建并应用TAT细胞穿透肽进行竞争性结合干扰实验。

研究结果

1. MYCBP维持有丝分裂中准确的染色体排列与分离

免疫荧光分析显示，MYCBP在间期呈弥散分布，在前中期和中期定位于动粒和纺锤体微管，后期动粒信号逐渐减弱，胞质分裂后恢复弥散模式。蛋白表达分析表明MYCBP水平在整个细胞周期中保持恒定，无周期性波动。在HeLa和HCT116细胞中敲低MYCBP导致严重的染色体排列缺陷和多极纺锤体形成，后期出现滞后染色体和染色体桥的比例显著升高，这些表型与Astrin敲低相似。

2. MYCBP增强动粒-微管附着的稳定性

活细胞成像显示，MYCBP敲低细胞经历长时间中期停滞超过90分钟，染色体无法有效排列在赤道板，部分细胞最终凋亡。冷稳定动粒微管（k-fiber）分析表明，MYCBP缺失导致冷处理后保留的k-fiber数量显著减少，证明MYCBP强化了KT-MT连接的稳定性。对照实验排除了MYCBP敲低影响关键有丝分裂激酶和动粒蛋白表达的可能性。

3. MYCBP调控Astrin复合体的动粒定位

Western blot分析显示，敲低Astrin或SKAP会导致其他亚基蛋白水平下降，而敲低MYCBP不影响Astrin和SKAP的蛋白稳定性。然而，MYCBP敲低导致Astrin和SKAP在动粒的定位信号显著降低约50%。内源性免疫沉淀实验表明，MYCBP敲低后Astrin抗体捕获的SKAP量明显减少，提示MYCBP可能作为关键调控因子维持Astrin复合体在动粒的招募或稳定结合。

4. MYCBP的两个N端α螺旋对其功能和定位至关重要

AlphaFold3预测揭示MYCBP N端含有两个α螺旋构成与SKAP的直接结合界面。通过引入R15P-V30P双点突变破坏这两个α螺旋（MYCBP^2P），免疫共沉淀证实该突变严重削弱了与SKAP的结合能力。在RNA干扰回救实验中，GFP-MYCBP^WT能精确定位到动粒并挽救敲低表型，而GFP-MYCBP^2P失去动粒靶向能力，呈现弥散胞质分布，无法纠正染色体排列异常和纺锤体形态缺陷。活细胞成像进一步确认，MYCBP^2P回救细胞中超过70%出现有丝分裂异常，包括持续中期停滞和滞后染色体。

5. 干扰MYCBP与SKAP相互作用改变染色体分离

研究人员构建了含TAT细胞穿透肽的MYCBP^1-40融合蛋白进行竞争性干扰。体外GST pull-down实验证实TAT-GFP-MYCBP^1-40能有效阻断GST-MYCBP与GFP-SKAP的结合。细胞实验中，处理TAT-GFP-MYCBP^1-40后，内源性MYCBP的动粒定位信号显著减弱，超过55%的细胞出现染色体排列错误，13.8%出现多极纺锤体。活细胞成像显示，处理组细胞有丝分裂异常比例从对照组的33.1%升至68.9%，重现了MYCBP敲低的表型。

讨论与结论

本研究系统阐明了MYCBP在有丝分裂中的定位及其对动粒功能的影响，证明MYCBP是Astrin复合体的稳定组分，其N端结构域介导该复合体正确定位于动粒，从而确保KT-MT附着稳定性和精确染色体分离。研究表明MYCBP并非被动组分，而是复合体动粒定位的关键因子，这种相互依赖的定位特征类似于NDC80复合体亚基间的依赖性。基于研究结果，研究人员提出工作模型：MYCBP作为分子胶水强化Astrin-SKAP相互作用并将复合体锚定在KT-MT界面。MYCBP不直接接触微管或动粒组分，而是防止Astrin-SKAP复合体从其功能位点解离。Astrin负责将整个复合体招募至动粒，SKAP提供微管结合活性，MYCBP则通过稳定Astrin-SKAP互作维持复合体功能完整性。该研究还揭示了MYCBP的非转录功能，提示该蛋白可能通过双重途径促进肿瘤发生：一方面作为c-MYC转录共激活因子促进增殖基因表达，另一方面作为动粒组分导致有丝分裂错误和基因组不稳定。研究结论指出：MYCBP-SKAP相互作用通过协调动粒-微管附着建立了忠实的染色体分离，MYCBP N端结构域介导与SKAP的结合和Astrin复合体的动粒定位，从而确保稳定的KT-MT附着和精确的染色体分离。这些结果为未来开发靶向MYCBP-Astrin/SKAP相互作用界面的抑制剂奠定了基础。