强效拮抗剂GSK2820986A抑制TRPC3的结构机制及S4-S5口袋结合位点鉴定

《Journal of Biological Chemistry》：Structural mechanism of TRPC3 inhibition by a potent antagonist

　　

瞬时受体通道经典家族成员3（TRPC3）是TRP超家族内的非选择性、钙通透阳离子通道。TRPC3在可兴奋和不可兴奋细胞中均有表达，在此整合多种信号通路，并在G蛋白偶联受体（GPCR）激活后通过二酰甘油（DAG）结合而被直接激活。TRPC3信号增强与多种疾病相关，提示TRPC3是潜在治疗靶点。然而，由于该通道与相关家族成员尤其TRPC6具有高度结构和序列同源性，开发具有合适效价和选择性的TRPC3抑制剂一直困难。在此，研究人员提出一种具有苯胺基-噻唑药效团（anilino-thiazole pharmacophore）的高效TRPC3拮抗剂（GSK2820986A）。通过分子动力学模拟（MD）和功能测定（functional assays）相结合，研究人员鉴定GSK2820986A在S4-S5口袋中的推定结合位点，并提出潜在抑制机制。研究结果提供一种强效工具化合物和机制框架，以推进TRPC3的研究和治疗靶向。

研究人员围绕瞬时受体电位经典家族成员3（TRPC3）抑制机制开展研究。TRPC3属于大型异质性瞬时受体电位（TRP）通道超家族，是四聚体、非选择性、钙通透阳离子通道，作为G蛋白偶联受体（GPCR）下游多功能信号分子。TRPC3与TRPC6、TRPC7同属TRPC3/6/7亚家族，序列相似性约70-80%。其主要激活机制被认为是脂质分子二酰甘油（DAG）直接结合于一个亚基S6与另一亚基孔环螺旋之间的窗孔；TRPC3还表现出DAG非依赖性本构活性。TRP通道具有保守的S1-6跨膜结构域（TMD）架构，包含膜再进入孔环，以及电压传感结构域（VSD）或TRP通道中等效的电压传感样结构域（VSLD）。TRPC3还含细胞内锚蛋白重复结构域（ARD）和两个特征性C端螺旋，即“水平”和“垂直”螺旋。C端可通过钙调蛋白在钙调蛋白/IP₃R结合结构域（CIRB）结合而抑制，经IP₃R在CIRB结合而激活，并经钙直接结合而抑制。TRPC3在神经系统尤其小脑浦肯野细胞高表达，参与感觉运动整合。功能增益（GOF）突变可导致小脑疾病：Moonwalker（Mwk）小鼠p.T561A位于S4-S5连接区，脊髓小脑共济失调41型（SCA41）患者p.R677H位于TRP螺旋，二者空间靠近并接近孔，影响门控。TRPC3活性增加还涉及其他SCA亚型、癫痫、慢性瘙痒、心血管病理及多种癌症。由于TRPC3与TRPC6高度同源，开发选择性抑制剂困难；共同靶向TRPC6可能产生不良后果，因TRPC6参与肺和肾脏生理。此前对TRPC3结构和功能机制理解不完整。为此，研究人员提出高效TRPC3抑制剂GSK2820986A（GSK-986），该化合物来自基于苯胺-噻唑药效团的TRPC3/TRPC6阻断剂项目，具有亚纳摩尔抑制效力并选择性高于TRPC6，结合位点被鉴定为S4-S5连接区残基Q555。该研究提供工具化合物和机制框架，有助于推进选择性TRPC3拮抗剂的开发。

关键技术方法概括：高通量筛选采用卡巴胆碱刺激膜电位FLIPR测定，使用人/鼠TRPC3过表达HEK293细胞；采用自动穿孔膜片钳IonWorks Quattro及手动全细胞膜片钳；采用Neuro-2a细胞NFAT-GFP核转位功能测定；通过定点突变引入Q555A等突变。计算方面，将TRPC3结构PDB 6CUD嵌入POPC双层，使用QuickVina-W对接，并以GROMACS进行分子动力学（MD）模拟。未涉及患者队列；使用HEK293、HEK293T、Neuro-2a、CHO-K1等细胞系，GSK-986由GSK提供。

研究结果保留原文小标题并浓缩如下。

GSK-986是TRPC3强效抑制剂且对TRPC6具选择性。通过FLIPR测定，GSK-986抑制TRPC3的pIC₅₀分别为8.15（IC₅₀=7 nM，hTRPC3）和8.7（IC₅₀=2 nM，rTRPC3），对TRPC6约十倍选择性。自动穿孔膜片钳IonWorks Quattro显示pIC₅₀为7.43（IC₅₀=37 nM，hTRPC3）和7.2（IC₅₀=63 nM，mTRPC3）。手动全细胞膜片钳验证IC₅₀=0.08 nM。GSK-986对相关TRP通道及心脏毒性相关离子通道活性低，IC₅₀>10 μM。NFAT-GFP核转位实验中，GSK-986显著降低野生型TRPC3及SCA41 p.R677H突变体的最大活性。

计算方法预测香草酸样S4-S5口袋为GSK-986结合位点。将TRPC3结构PDB 6CUD嵌入POPC双层后，QuickVina-W对接显示配体主要聚集于S4-S5口袋和VSLD胞外位点；四个亚基中三个的S4-S5口袋被占据。定向对接反复显示配体中心羰基与S4-S5连接区Q555接触。MD模拟3×500 ns中，稳定姿态在三次模拟的两次中维持，配体尾部由S6的I641转向S4的V535，中心羰基与Q555侧链接触。GOF突变亦聚集于S4-S5区域，TRPC6中BTDM结合姿态类似。

功能验证支持TRPC3 S4-S5口袋为GSK-986相互作用位点。Q555A突变不影响TRPC3电流密度及GSK1702934A激活，但显著削弱GSK-986对NFAT转位的抑制，且对野生型、SCA41 p.R677H及Mwk p.T561A均如此。其他五个残基W457A、S539A、L558A、G559A、M574A中，仅L558A显著损害抑制；L558I可恢复抑制，提示疏水接触参与稳定结合。TRPC3与TRPC6差异残基中，F577V显著损害GSK-986抑制；TRPC3 F577可与相邻S4的F538形成π堆积，TRPC6对应V646不能。

TRPC3 Q555A损害SAR7334抑制，支持提出的共享抑制机制。S4-S5口袋存在抑制性脂质，S1-S3口袋抑制剂SAR7334及AM-1473可能通过该脂质发挥抑制。SAR7334对SCA41-Q555A的抑制显著受损。为排除S1-S3口袋作为GSK-986结合位点，研究人员对接并突变D461、H377、S439、Y543为丙氨酸，均未显著影响抑制，支持GSK-986结合于S4-S5口袋。

讨论部分总结：GSK-986是迄今报道最强效的TRPC3抑制剂之一，手动膜片钳测得IC₅₀=0.08 nM。其结合位点与BTDM、GSK417651A等苯胺-噻唑衍生抑制剂类似。既往结构比较显示，抑制剂结合时S4-S5连接螺旋维持向上构象，而激活剂结合时呈向下构象；研究人员据此提出GSK-986通过稳定S4-S5连接区向上构象而抑制通道。GSK-986与V535和Q555的相互作用可能偶联S4-S5连接区与S4螺旋，阻止激活构象传播。构效关系数据显示，去除中心羰基可消除TRPC3拮抗作用。Q555A损害SAR7334抑制支持脂质介导的共享机制。TRPC3中R560-E672盐桥、PIP₂第三脂质位点（L3）及开放态结构等证据支持S4-S5连接区与TRP螺旋偶联在通道激活中的作用。研究人员提出GSK-986稳定S4-S5连接区，损害TRP与S4-S5连接螺旋的偶联，阻止激活构象传播，从而实现抑制；F577V影响S5构象变化，可能参与GSK-986对TRPC3优于TRPC6的选择性。

研究结论部分翻译：总体而言，研究人员提出高效TRPC3抑制剂GSK-986的结合位点为香草酸样S4-S5口袋。该工作再次确认S4-S5结合口袋是TRPC3调控的关键位点，并支持一种提出的通道抑制机制，即稳定S4-S5连接区以阻止其向活性状态构象转变。这些关于在S4-S5口袋抑制TRPC3的见解与药物开发相关，并将为对抗与TRPC3活性增加相关的多种病理的未来治疗策略提供信息。