《Journal of Advanced Research》：Sequential modulation of the cGAS-STING pathway promotes spinal cord injury repair
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全球每年有数十万人被诊断为脊髓损伤（spinal cord injury, SCI），其中90%的病例归因于交通事故、坠落、运动相关损伤和暴力等创伤性事件。SCI切断大脑与脊髓之间的神经通讯，导致严重且往往永久性的神经功能缺损，包括感觉和运动障碍、异常反射弧以
全球每年有数十万人被诊断为脊髓损伤（spinal cord injury, SCI），其中90%的病例归因于交通事故、坠落、运动相关损伤和暴力等创伤性事件。SCI切断大脑与脊髓之间的神经通讯，导致严重且往往永久性的神经功能缺损，包括感觉和运动障碍、异常反射弧以及自主神经调节紊乱，最终显著降低患者生活质量，甚至可能缩短其寿命。目前SCI的临床管理主要包括早期手术减压和稳定、增强脊髓灌注、静脉注射大剂量糖皮质激素进行抗炎治疗，以及长期神经康复训练，但遗憾的是这些干预措施的疗效仍然有限。
SCI的病理生理过程包括原发性损伤和继发性损伤两个阶段。由于原发性损伤不可逆，SCI的总体严重程度在很大程度上取决于继发性损伤的程度。研究表明，SCI后适应性免疫和固有免疫反应的过度激活及其伴随的神经炎症是继发性损伤的关键机制。因此，选择性调节免疫反应以减轻继发性损伤已成为促进损伤脊髓修复和改善功能恢复的主要治疗策略。
干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes, STING）是一种内质网（endoplasmic reticulum, ER）相关信号分子，与环状GMP-AMP合酶（cyclic GMP-AMP synthase, cGAS）协同，通过复杂而精确的调控机制识别源自病原体、细胞损伤或应激反应的异常双链DNA（double-stranded DNA, dsDNA）。作为固有免疫系统的核心组成部分，cGAS-STING通路不仅在微生物防御中发挥关键作用，还参与多种生理和病理过程，包括自噬、炎症、衰老、代谢稳态、DNA损伤反应、自身免疫、癌症生物学和细胞死亡等。此外，在神经系统中，cGAS-STING通路已被证实与脑损伤、阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病以及神经病理性疼痛的发生发展相关。
近期研究强调了cGAS-STING信号通路在SCI病理过程中的重要性。Wang等人证明SCI后STING表达显著上调，通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）和NF-κB信号通路参与继发性损伤中的神经炎症反应。Wei等人进一步揭示SCI后线粒体融合蛋白2（mitofusin 2, Mfn2）的上调减少了小胶质细胞线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）的释放，从而限制cGAS-STING通路的激活并减轻损伤后神经炎症。Fan等人利用小分子化合物tryptanthrin抑制cGAS-STING通路，促进小胶质细胞向抗炎表型极化，显著增强了SCI小鼠的功能恢复。这些发现共同表明，靶向cGAS-STING信号通路可能为促进SCI修复和功能恢复提供有前景的治疗策略。
在本研究中，研究人员利用小鼠脊髓压迫性损伤模型，探讨了cGAS-STING通路在SCI中的作用。研究结果表明，SCI后cGAS-STING通路主要在髓系细胞（尤其是小胶质细胞）中被激活。通过在SCI后不同时间窗口使用STING特异性拮抗剂或激动剂进行药理学干预，研究人员发现该通路的时序性激活后抑制（即早期激活、晚期抑制）能显著增强功能恢复。进一步分析揭示，髓系细胞（以小胶质细胞为关键效应细胞）是cGAS-STING通路介导修复的关键。重要的是，基于SCI的病理进展，该研究提出了一种涉及精确定时调节STING通路以改善SCI后功能恢复的新策略。
论文解读
一、研究背景与科学问题
脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）是全球范围内导致严重神经功能缺损的重大疾病，每年新发病例达数十万，其中约90%源于交通事故、坠落、运动损伤和暴力等创伤事件。SCI切断大脑与脊髓之间的神经通讯，造成感觉和运动功能障碍、反射弧异常及自主神经调节紊乱，严重影响患者生活质量并缩短预期寿命。目前临床治疗手段主要包括早期手术减压与稳定、增强脊髓灌注、大剂量糖皮质激素抗炎治疗及长期康复训练，但疗效十分有限。
SCI的病理过程分为原发性损伤和继发性损伤两个阶段。原发性损伤由急性机械创伤直接导致，不可逆转；而继发性损伤涉及氧化应激、兴奋性毒性、代谢紊乱、神经炎症、胶质增生、细胞外基质重塑、脱髓鞘和瘢痕形成等一系列级联事件，其严重程度决定了SCI的总体预后。大量研究证实，SCI后适应性免疫和固有免疫的过度激活及其伴随的神经炎症是继发性损伤的关键机制，因此选择性调节免疫反应以减轻继发性损伤已成为促进损伤脊髓修复的核心治疗策略。
cGAS-STING信号通路是固有免疫系统的核心组成部分。cGAS作为模式识别受体（pattern recognition receptor, PRR）感知细胞质中的异常双链DNA（double-stranded DNA, dsDNA），产生第二信使2′3′-环状GMP-AMP（2′3′-cyclic GMP-AMP, cGAMP），激活STING并启动下游TBK1-IRF3/NF-κB信号级联，促进I型干扰素（Type I IFN）和其他炎症因子的分泌。该通路不仅参与微生物防御，还涉及自噬、炎症、衰老、DNA损伤反应、自身免疫和癌症生物学等多种生理病理过程。在神经系统中，cGAS-STING通路与脑损伤、神经退行性疾病及神经病理性疼痛密切相关。已有研究证实SCI后STING表达显著上调并通过MAPK和NF-κB通路加剧神经炎症，抑制该通路可促进小胶质细胞向抗炎表型极化并改善功能恢复。然而，cGAS-STING通路在SCI不同病理阶段的确切作用及其时序性调控策略尚不清楚，这构成了本研究开展的核心科学问题。
二、主要技术方法
研究人员建立了稳定的小鼠T10节段脊髓压迫性损伤模型（使用尖端1 mm、手柄间含0.55 mm垫片的镊子压迫5秒），采用双盲Basso Mouse Scale（BMS）评分和足迹分析评估运动功能。研究综合运用了多种关键技术：时间序列转录组测序（RNA sequencing）分析损伤核心组织（sham、3 dpi、14 dpi）的基因表达变化；空间转录组数据分析确定通路激活的细胞类型；免疫荧光染色和Western blot（WB）检测通路蛋白表达与激活；透射电镜（TEM）和Luxol fast blue（LFB）染色评估髓鞘完整性；qRT-PCR验证基因表达；药理学干预使用STING激动剂（ADU-S100、2′3′-cGAMP）和抑制剂（C-176、H-151），采用局部注射联合腹腔注射的给药方式；PLX5622（CSF1R抑制剂）实现髓系细胞耗竭；体外实验包括原代小胶质细胞培养、胚胎期运动神经元培养、微流控轴突切断模型及共培养体系；RNA-seq数据分析使用DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs），并进行GO功能注释、GSEA通路富集分析和KEGG核心网络构建。此外，研究人员还重新分析了Li等人公开发表的SCI转录组数据集（figshare平台，涵盖15分钟至42天时间点）以确定炎症转换节点。
三、研究结果
1. SCI后脊髓中cGAS/STING通路相关基因上调
通过时间序列转录组测序，研究人员鉴定出3 dpi和14 dpi分别有7,269个和5,642个显著差异表达基因。聚类分析揭示四种时间表达模式，其中持续上调的基因显著富集于炎症和免疫调节过程，而离子转运和突触传递相关基因持续下调。GSEA和KEGG核心网络分析显示“胞质DNA感知通路”在3 dpi和14 dpi均显著富集，其核心组件即cGAS-STING信号轴。关键通路基因（包括Sting1、cGAS、IRF1、IRF3、IRF8、TNF和IL-6）在转录组和qPCR中均持续上调，表明该通路在SCI后持续激活。
2. SCI后cGAS-STING信号通路的激活及小胶质细胞优势表达
Western blot结果显示SCI后cGAS和STING蛋白水平显著上调，伴随TBK1磷酸化增强，证实通路持续激活。免疫荧光双标染色显示，未损伤组织中STING主要与NeuN?神经元共定位；SCI后STING和cGAS表达显著增加于F4/80?吞噬细胞（小胶质细胞/巨噬细胞），且主要与TMEM119?小胶质细胞共定位，少数与CD14?浸润巨噬细胞重叠。空间转录组数据进一步支持cGAS-STING通路在SCI后主要于髓系细胞（以小胶质细胞为主）中被激活。
3. 时序性而非持续性调控cGAS-STING通路促进SCI修复
持续性激动或抑制STING通路均未能维持长期功能恢复。基于SCI炎症反应的双相模式（约0-14天为急性至亚急性炎症期，14天后持续炎症阻碍修复），研究人员通过分析公开转录组数据集确认第14天为促炎向消退期转换的关键节点，并考虑腹腔给药约24-48小时的生物利用度滞后，选择第11天作为药物切换点。时序性治疗方案为：SCI后立即局部注射激动剂或抑制剂，第1-10天每日腹腔注射相同药物，第11天交叉切换（ADU-S100→C-176或C-176→ADU-S100）持续至第28天。p-TBK1水平检测证实了预期的时序性通路调节效果。BMS评分显示从14 dpi起，ADU-S100→C-176组后肢运动恢复显著优于对照组，而C-176→ADU-S100组无改善。足迹分析显示ADU-S100→C-176组步幅长度显著增加。Tuj1/CSPG双标染色表明该组Tuj1?纤维更多、胶质瘢痕更小。LFB染色、TEM和WB分析一致证实ADU-S100→C-176组脱髓鞘面积最小、MBP水平最高、有髓轴突数量最多，而C-176→ADU-S100组脱髓鞘最严重。g-ratio分析显示ADU-S100→C-176组厚髓鞘轴突比例最高、无髓鞘轴突比例最低。
4. RNA测序揭示时序性cGAS-STING通路调节有益效应的双相机制
3 dpi转录组分析显示，早期STING抑制组仅MT3（金属硫蛋白-3，一种中枢神经系统富集的金属蛋白）显著上调，而早期STING激活组除MT3外还有924个独特DEGs，包括颗粒酶家族成员（Gzma、Gzmb、Gzmc、Gzmf、Gzmd等）和多种趋化因子（CXCL10、Ccl5、Ccl8、Ccl2、Ccl7等）显著上调，以及Ly6C2表达增加，表明早期STING激活促进免疫细胞浸润和受损细胞清除。14 dpi转录组分析显示，ADU-S100→C-176组的颗粒酶和趋化因子表达已恢复至基线水平，而C-176→ADU-S100组则出现趋化因子和促炎细胞因子（IL-6、IL-1β）显著上调及中性粒细胞标志物S100a8/S100a9持续高表达。值得注意的是，ADU-S100→C-176组抗炎细胞因子IL-10显著升高。此外，该组轴突生长相关基因（Tubb3、Map2、Nefl、Nefh、Nefm、DCX）显著上调，DCX免疫组化证实新生轴突标志物信号显著增强。
5. 髓系细胞耗竭消除时序性STING通路调节的治疗效益
使用PLX5622（CSF1R抑制剂）分别进行早期（SCI前3天至伤后7天）和晚期（伤后9-14天）髓系细胞耗竭，耗竭效率达80-90%。BMS评分显示，无论早期还是晚期耗竭，均显著损害ADU-S100→C-176、C-176→ADU-S100和vehicle组的运动恢复，且耗竭后各组间无显著差异。ADU-S100→C-176治疗减少的神经元凋亡在髓系细胞耗竭后消失。LFB染色和TEM分析显示髓系细胞耗竭导致所有治疗组脱髓鞘面积增加、髓鞘保留减少。研究人员未在星形胶质细胞中检测到cGAS或STING表达，排除其直接参与该调控机制的可能。
6. cGAS-STING通路激活促进运动神经元轴突生长和再生
体外实验显示，STING激动剂处理运动神经元24小时显著升高p-TBK1水平并上调轴突生长标志物GAP43，而抑制剂则产生相反效应。免疫细胞化学证实激动剂增强轴突生长（长轴突和超长轴突比例增加），抑制剂减少轴突生长。在微流控轴突切断模型中，激动剂处理显著增强轴突再生，而抑制剂无显著影响。这一神经元内在的促再生效应与体内需要晚期通路抑制才能达到最佳恢复形成鲜明对比，提示晚期STING抑制的体内有益效应可能通过缓解持续炎症微环境间接实现。
7. 小胶质细胞中的cGAS-STING通路通过神经元互作调节神经炎症和吞噬作用以影响轴突生长
共培养实验显示，与受损神经元共培养的小胶质细胞TNF-α和IL-6表达显著升高，STING通路活性增强（p-TBK1升高），并呈现纺锤样极化形态。小胶质细胞极化标志物（iNOS、CCL2、F4/80、CD68）表达上调，STING表达增加。在受损共培养体系中，STING激动剂增强轴突再生和GAP43表达，而抑制剂则抑制这些效应。条件培养基实验证实受损神经元释放的因子（如dsDNA）是小胶质细胞STING激活的关键触发因素。吞噬实验表明STING通路调节小胶质细胞对荧光微球和tdTomato标记神经元碎片的吞噬能力。
四、讨论与结论
本研究基于SCI的病理进展，首次提出“时间免疫调节”（chrono-immunomodulation）新范式：早期STING激活通过上调颗粒酶和趋化因子促进免疫细胞浸润和受损细胞清除，为后续修复创造条件；晚期STING抑制则通过诱导IL-10等抗炎因子减轻持续炎症，建立有利于神经修复的微环境，促进轴突保留和髓鞘完整性。髓系细胞（以小胶质细胞为关键效应细胞）是这一调控机制的核心执行者。研究结论表明，时序性调控cGAS-STING通路（早期激活联合晚期抑制）而非持续性激活或抑制，可显著促进SCI后功能恢复和组织修复，为SCI治疗提供了精准时间窗口干预的新策略，具有重要的临床转化潜力。该研究发表于《Journal of Advanced Research》。
