韩国鹿科动物源 Lipoptena fortisetosa 的全国性监测、线粒体遗传多样性及关联微生物研究

《International Journal for Parasitology: Parasites and Wildlife》：Nationwide surveillance, mitochondrial genetic diversity, and associated microorganisms of Lipoptena fortisetosa collected from cervids in the Republic of Korea

　　

鹿虱（deer keds；双翅目：虱蝇科，Lipoptena spp.）是野生哺乳动物尤其是鹿科动物（cervids）的专性吸血外寄生虫，广泛分布于欧洲和亚洲。全球已描述约30种 Lipoptena。来自韩国（Republic of Korea, ROK）的已发表记录记载了 L. cervi 和 L. fortisetosa。与主动寻找宿主的吸血昆虫如蚊不同，新出现的鹿虱通常停留在植被上，直到合适宿主经过附近，之后仅飞行短距离即附着。附着后，它们脱落翅膀，并在宿主上度过大部分成年期，反复吸食血液并通过腺营养性胎生（adenotrophic viviparity）繁殖。由于鹿虱寄生于可能与家畜和人类环境相互作用的自由放养鹿科动物，它们是野生动物-家畜-人类界面相关监测目标。

除在严重感染动物中引起刺激、皮炎和偶发贫血外，鹿虱因在这些昆虫中检测到多种微生物的DNA或RNA而日益受到关注。既往研究报告了鹿虱中的 Anaplasma spp.、Bartonella spp.、Borrelia spp.、Coxiella-like organisms、Theileria spp.、Trypanosoma spp.、Rickettsia spp. 和严重发热伴血小板减少综合征病毒（severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV）。尽管这些发现表明其暴露于野生动物系统中循环的微生物，但仅分子检测不能证明生物媒介能力（vector competence），后者需要病原体存活、复制和在宿主间传播的证据。尽管如此，鹿虱仍是监测与鹿科动物系统相关微生物的有用目标。

在韩国，两个主要鹿科宿主是韩国水鹿（water deer, Hydropotes inermis），广泛分布于大陆，以及西伯利亚狍（Siberian roe deer, Capreolus pygargus），在济州岛丰富。鹿科动物种群增加以及野生动物、家畜和人类环境之间接触扩大，可能增加人类和家畜遇到鹿虱及在这些外寄生虫中检测到的病原体的机会。因此，从兽医和公共卫生角度，了解鹿虱当前分布及在其中检测到的病原体DNA日益重要。

历史上，L. cervi 曾从大陆韩国水鹿中报告。L. fortisetosa 随后从济州岛记录，最初为一个未知宿主的单一样本，后来从西伯利亚狍中大量记录。后续大陆研究从一只路杀韩国水鹿中鉴定出 L. fortisetosa，并检测到 Coxiella-like bacteria 和 Theileria DNA。最近，在韩国中部野生动物采集的 L. fortisetosa 中检测到 SFTSV RNA。这些研究确定了 L. fortisetosa 及若干相关微生物在韩国的存在，但受地理限制，其全国发生、线粒体多样性和更广泛微生物谱仍未充分表征。

在本研究中，研究人员于2025年在韩国九个省份对从鹿科动物采集的鹿虱进行了全国性监测。研究人员进行了形态学鉴定和基于 COX1 的分子分析，表征了线粒体遗传多样性和种群结构，并使用序列确认作为最终检测基础，筛查了选定的病毒、细菌和原生动物微生物。该研究旨在提供鹿虱发生和遗传多样性的更新基线信息，同时在相关微生物分析中考虑基于宿主的聚类采样结构。

论文主体解读：

研究背景与问题：鹿虱（deer keds；双翅目：虱蝇科，Lipoptena spp.）是野生哺乳动物尤其鹿科动物（cervids）的专性吸血外寄生虫，全球约30种。韩国既往记录 L. cervi 与 L. fortisetosa，但既往研究地理受限，全国发生、线粒体多样性及更广泛微生物谱未充分表征。韩国主要鹿科宿主为大陆韩国水鹿（Hydropotes inermis）和济州岛西伯利亚狍（Capreolus pygargus）。鹿科动物种群增加及野生动物-家畜-人类接触增加，使了解鹿虱分布及其携带微生物DNA具有兽医和公共卫生意义。既往在鹿虱中检测到 Anaplasma spp.、Bartonella spp.、Borrelia spp.、Coxiella-like organisms、Theileria spp.、Trypanosoma spp.、Rickettsia spp. 及严重发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）等，但分子检测不能证明媒介能力（vector competence）。因此，研究人员2025年在韩国九省开展全国性监测，整合线粒体群体遗传学与序列确认微生物监测，并考虑基于宿主的聚类采样结构。

关键技术方法：2025年6—11月，通过区域野生动物管理活动获得116头鹿科动物，采集405只鹿虱；大陆101头 H. inermis 来源315只，济州15头 C. pygargus 来源90只。所有标本进行形态鉴定；选186只进行 COX1 扩增测序，617 bp比对，用 DnaSP v6、PopART、AMOVA和中性检验分析；定制 qPCR/qRT-PCR 筛查 SFTSV、Babesia/Theileria、Anaplasma/Ehrlichia/Borrelia；阳性池解池后常规PCR、Sanger测序确认；Bartonella用 gltA 重评估；MEGA12 最大似然树，glmmTMB 二项广义线性混合模型，宿主随机截距，区域固定效应。

结果：Deer ked identification（鹿虱鉴定）：405只鹿虱来自116头鹿科动物，315只来自大陆，90只来自济州；350只为雌性，55只为雄性。所有标本形态鉴定均为 L. fortisetosa，186只 COX1 测序结果一致，未发现其他 Lipoptena 物种。

Genetic diversity analysis（遗传多样性分析）：186条 COX1 序列比对长度617 bp，34个分离位点，35个突变，6个单例可变位点，28个简约信息位点，29个单倍型。总单倍型多样性（Hd）为0.681 ± 0.038，核苷酸多样性（π）为0.01262 ± 0.00101，平均成对核苷酸差异为7.786。济州标本 Hd = 0.803 ± 0.077、π = 0.01399 ± 0.00234；大陆标本 Hd = 0.587 ± 0.046、π = 0.00900 ± 0.00113。Hap 10 为最常见单倍型，遍布九个省份。单倍型网络和 COX1 最大似然分析形成三个描述性线粒体分支。省间分析分子方差（AMOVA）显示显著分化，Φ_ST = 0.303，P < 0.001，30.32%分子方差来自省间；济州与大陆分组分化更强，Φ_ST = 0.615，P < 0.001，61.48%方差来自组间。因宿主物种和地理来源完全混杂，该结果描述采样组间分化，而非独立地理或宿主物种效应。中性统计未显示显著偏离中性预期或近期群体扩张证据。186条 COX1 序列登录号为 PZ852184-PZ852369。

Sequence-confirmed detection of selected microorganisms（选定微生物的序列确认检测）：序列确认的微生物检出率为 Bartonella spp. 94/405（23.21%，95% CI 19.36-27.56%），宿主水平37/116（31.90%，95% CI 24.11-40.84%）；Theileria spp. 40/405（9.88%，95% CI 7.34-13.17%），宿主水平28/116（24.14%，95% CI 17.26-32.67%）；Coxiella-like organisms 4/405（0.99%，95% CI 0.38-2.51%），宿主水平4/116（3.45%，95% CI 1.35-8.53%）；Anaplasma capra 2/405（0.49%，95% CI 0.14-1.78%），宿主水平2/116（1.72%，95% CI 0.47-6.07%）。未获得序列确认的 Babesia spp.、Ehrlichia spp.、Borrelia spp.、Hepatozoon spp. 或 SFTSV。

其中，Anaplasma 筛查中13/91池反应，对应56只鹿虱；解池后3个标本获得预期16S rRNA条带，DK-0008和DK-0039鉴定为 A. capra，DK-0046序列质量不足；两条 A. capra 序列长1,029 bp，登录号 PZ854640-PZ854641。Coxiella 筛查中5个标本获得预期16S rRNA条带，4个确认 Coxiella-like organisms，1个为非目标序列；四个680 bp序列位于节肢动物相关 Coxiella-like 谱系，而非 C. burnetii，登录号 PZ862439、PZ889904-PZ889906。Theileria 筛查中93/203池 qPCR 反应，对应186只鹿虱；169/186标本获得预期18S rRNA条带，40个获得可解释 Theileria 序列并判为序列确认检出；35条序列用于293 bp系统发育分析，代表7个序列型，与 T. luwenshuni、T. cervi、T. capreoli 相关谱系有广泛亲缘性；因片段短且保守，仅用于宽泛谱系定位。登录号 PZ852376-PZ852410。SFTSV 筛查中8/203池 qRT-PCR 反应，对应16只鹿虱；后续常规PCR均阴性，无序列确认。Ehrlichia 4/91池反应，16只标本均阴性；Borrelia 12/91池反应，48只标本中1个获得预期条带但测序不成功；Babesia 0/203池；Hepatozoon 0/405。

Bartonella 重评估中，原 rpoB 分析无预期条带；379-bp gltA 预筛从186/405（45.9%）鹿虱获得预期产物；其中95/186获得约790-bp gltA 条带并测序，94个标本获得可解释 Bartonella 序列（23.21%）。92个清洁色谱用于系统发育，50个与 B. schoenbuchensis 参考序列聚集，42个形成独特的鹿虱相关 Bartonella 谱系，保守称为 Bartonella spp.。两个色谱在多态位点显示A/G重叠峰，提示可能混合 Bartonella 基因型。序列确认的 Bartonella 检出集中于济州：济州63/90，大陆31/315；宿主水平济州14/15，大陆23/101。混合模型显示宿主水平聚类很强（ICC = 0.98），纳入区域显著改善模型拟合（χ² = 16.19，P < 0.001；AIC 253.36 与 267.55），但区域系数出现准分离，比值比估计不稳定且极大，因此未定量解释。因区域与宿主物种完全混杂，该对比不能独立归因于地理或宿主物种。Theileria 宿主水平聚类亦明显（ICC = 0.46）；控制宿主身份后，济州与大陆检出差异不显著（OR = 1.28，95% CI 0.31-5.23，P = 0.731），纳入区域未改善模型拟合（χ² = 0.12，P = 0.730；AIC 254.69 与 252.80）。Bartonella gltA 序列登录号 PZ986991-PZ987084。

讨论总结：本研究提供韩国 L. fortisetosa 从鹿科动物采集的全国基线信息，整合线粒体群体遗传学与序列确认微生物监测。所有形态鉴定鹿虱均为 L. fortisetosa，186只 COX1 测序标本分子鉴定一致；研究还揭示采样济州与大陆组间明显线粒体分化，并在部分鹿虱中检出 Bartonella spp.、Theileria spp.、A. capra 和 Coxiella-like organisms。历史上 L. cervi 曾报告于韩国大陆水鹿，本次未检出不能解释为在韩国消失；采样基于野生动物管理活动中可获得的宿主，未采集主动寻找宿主的鹿虱，也未覆盖所有潜在鹿科宿主、季节或局部生态条件，因此低丰度、不同宿主关联或季节性活动的物种可能被遗漏。COX1 数据显示总体中等线粒体多样性，济州标本多样性高于大陆标本；单倍型网络、系统发育和 AMOVA 显示采样组间非随机线粒体结构，济州与大陆 AMOVA 中61.48%分子方差来自组间。因济州鹿虱全部来自 C. pygargus，大陆标本全部来自 H. inermis，地理与宿主物种完全混杂，不能确定分化机制；地理隔离、限制基因流、奠基者效应、人口历史和宿主相关结构均为非互斥可能，但本研究无法推断宿主偏好或适应。中性统计无显著近期扩张或偏离中性预期证据。

Bartonella spp. 是本研究最常序列确认的微生物。原 rpoB 阴性而后续 gltA 检出94只鹿虱，提示引物适用性和试验设计可能影响遗传多样性野生动物相关 Bartonella 的检测。B. schoenbuchensis 相关序列型强烈集中于济州样本，而未分类 Bartonella 谱系分布更广；两个样本显示序列型特异SNP位点A/G混合峰，提示可能混合基因型，但直接Sanger测序不能解析混合基因型组成，因此仅作提示性而非确定性混合感染证据。Bartonella 检出在来自同一宿主的鹿虱中明显聚类，并呈济州-大陆对比，但极端不平衡导致混合模型准分离，且宿主物种与地理完全混杂，不能独立归因。频繁检出说明 Bartonella 与鹿虱关系密切，但分子检测不能建立媒介能力或传播能力。Theileria 在40只鹿虱中序列确认；控制多只鹿虱在同一宿主内的聚类后，济州-大陆无显著差异；293 bp 18S rRNA 片段提供宽泛系统发育定位，但因短且高度保守，限制近缘种物种水平分辨。A. capra 在2只鹿虱中确认；该菌为新兴蜱传人兽共患细菌，曾报告于家养反刍动物、蜱、野生动物和人类，本次检测扩展了韩国节肢动物样本中观察到 A. capra DNA 的范围，但不证明鹿虱可生物传播。4只鹿虱含 Coxiella-like organisms 序列，与节肢动物相关 Coxiella 谱系聚类而非 C. burnetii；此类 Coxiella-like organisms 常解释为吸血节肢动物中推定内共生体，而非确认病原体，其重复检出具有生态和共生意义，但不能仅由序列检测推断致病意义。未获得序列确认的 Babesia spp.、Ehrlichia spp.、Borrelia spp.、Hepatozoon spp. 或 SFTSV，不应解释为不存在；检测取决于宿主感染状态、地理和时间暴露、模板浓度和试验性能。SFTSV RNA 曾在韩国 L. fortisetosa 中检测到，本次8池 qRT-PCR 反应，但16只组成鹿虱均未获常规PCR条带；Ehrlichia 和 Borrelia 同样仅有筛查反应而无序列确认，因此最好描述为未确认筛查反应而非确立感染。局限包括采样不均匀，宿主物种与地理区域完全混杂，不适合估计感染强度或季节丰度，初筛基于混合样本且因商业试剂有限每池仅测一次，部分档案原始文件受阈值/基线改变影响，最终微生物检测基于序列确认而非仅筛查反应，且PCR检测不能证明微生物活力、复制或生物传播。

研究结论翻译：这项全国性调查显示，L. fortisetosa 与韩国各地受检鹿科动物广泛相关，并揭示采样济州岛和大陆群体之间存在显著线粒体遗传分化。Bartonella spp. 是最常经序列确认的微生物，其次是 Theileria spp.，而 A. capra 和 Coxiella-like organisms 检测频率较低。观察到的差异中地理和宿主物种成分无法区分，分子检测不能确定媒介能力。结果为标准化纵向监测以及未来鹿虱种群连通性和宿主-媒介-微生物相互作用研究提供基线。