精氨酸通过调节分子间的相互作用来稳定冻干的高浓度奥马珠单抗：对其干态特性的分析以及关于其复水和粘度行为的分子动力学研究

《International Journal of Pharmaceutics》：Arginine regulates intermolecular interactions to stabilize lyophilized high-concentration omalizumab: dry-state characterizations and molecular dynamics insights into reconstitution and viscosity

　　摘要
高浓度单克隆抗体制剂（HCMFs）在现代生物制药中得到了广泛应用，因为它们适合皮下注射且患者依从性更好。然而，冻干型HCMFs面临的主要技术障碍包括高溶液粘度、复溶时间延长以及过多的气泡形成，这些都会影响其制造可行性并阻碍临床应用。尽管精氨酸是一种有效的降低浓度蛋白溶液粘度的辅料，但其较低的玻璃化转变温度（Tg‘）会导致冻干不稳定性和药饼塌陷，从而限制了其在冻干产品中的使用。在这项研究中，开发了一种由海藻糖和低剂量精氨酸组成的二元辅料系统来克服上述限制。海藻糖的高Tg‘能够协同抵消精氨酸在浓蛋白基质中因低Tg‘而导致的缺陷，从而维持冻干奥马珠单抗的长期物理和化学稳定性。对复溶后的高浓度奥马珠单抗溶液进行的分子动力学模拟进一步揭示了降低粘度的机制。精氨酸减弱了蛋白质间的相互作用，扩大了抗体组装体的胶体半径（Rc），促进了水分渗透到胶体空隙中，并增强了分子的布朗运动，从而从根本上降低了溶液粘度并改善了复溶性能。总体而言，本研究阐明了精氨酸与冻干奥马珠单抗之间的不相容性，并为高浓度单克隆抗体制剂中粘度的分子调控提供了机制指导。

引言
基于蛋白质的生物制药产品，特别是单克隆抗体（mAb），已成为治疗多种疾病的基石，包括癌症、自身免疫性疾病和代谢性疾病。这些生物制剂的疗效通常依赖于剂量，因此在许多临床情况下需要使用较高剂量。然而，皮下注射作为一种方便且患者易接受的给药方式，原则上其注射体积通常不超过2毫升（Ren, 2025）。这一挑战加剧了对高浓度mAb制剂（HCMF）的需求，因为HCMF的浓度通常超过100毫克/毫升，这样才能在临床上可行的注射体积内提供有效剂量（Bramham et al., 2021, Ren, 2025）。从临床角度来看，HCMF有助于患者自我用药，减少临床就诊次数，提高治疗依从性，并降低医疗成本。此外，从商业角度来看，这类制剂是产品生命周期管理的战略工具，有助于在竞争市场中区分产品，并可以降低药物研发过程中的风险。这些临床和商业优势凸显了HCMF在现代生物制药研究中的战略价值。尽管有这些优势，但使用超滤技术（如切向流过滤）浓缩生物制药蛋白时存在一个主要瓶颈，即高浓度引起的粘度、蛋白质自身聚集和聚集所带来的实际限制，表现为显著的反压、膜污染和过滤速率降低。粘度的增加归因于蛋白质间的相互作用（PPI），这种相互作用促进了长寿命、可逆的簇的形成，在溶液中形成了半永久性的网络（Dear et al., 2017, Zeng et al., 2021）。高粘度还会引起注射部位疼痛，并降低患者用药时的依从性（Huang et al., 2022）。此外，由于分子拥挤和单克隆抗体在超高浓度下的构象灵活性，分子间相互作用加剧，导致明显的浑浊、更高的聚集倾向和相分离（Armstrong et al., 2024, Meza et al., 2023, Yadav et al., 2010）。另一种常见的工业方法是先填充低浓度蛋白溶液，然后进行冻干，再用少量溶液复溶以达到目标的高浓度。这种工艺简化了大规模生产并提高了操作便利性。冻干是一种有前景的策略，可以克服这些障碍，提高蛋白质的长期稳定性并减少运输过程中的物理应力（Fang et al., 2021）。然而，临床医生经常报告复溶时间过长和持续出现可见气泡（VBs），这会妨碍准确剂量控制，延迟给药，并降低工作效率和患者依从性（Gao et al., 2025a, Gao et al., 2024, Kulkarni et al., 2020, Kulkarni et al., 2021, Kulkarni et al., 2018）。延长的复溶时间还会增加产品暴露于环境条件的时间，从而增加潜在的质量风险。值得注意的是，Fang等人指出，塌陷的气泡可能会在依那西普制剂中引起局部加热和自由基生成，导致亚可见颗粒的形成——这揭示了一个非同寻常的蛋白质降解途径（Wang et al., 2014）。因此，尽管冻干在HCMFs的稳定性和物流方面具有明显优势，但仍需优化制剂和工艺以改善复溶性能并减少与粘度相关的问题。增强这些特性对于充分发挥高浓度蛋白药物的临床和商业潜力至关重要。

引言
基于蛋白质的生物制药产品，尤其是单克隆抗体（mAb），已成为治疗多种疾病的基石，包括癌症、自身免疫性疾病和代谢性疾病。这些生物制剂的疗效通常依赖于剂量，因此在许多临床情况下需要使用较高剂量。然而，皮下注射作为一种方便且患者易接受的给药方式，其注射体积原则上通常不超过2毫升（Ren, 2025）。这一挑战加剧了对高浓度mAb制剂（HCMF）的需求，因为HCMF的浓度通常超过100毫克/毫升，这样才能在临床上可行的注射体积内提供有效剂量（Bramham et al., 2021, Ren, 2025）。从临床角度来看，HCMF有助于患者自我用药，减少临床就诊次数，提高治疗依从性，并降低医疗成本。此外，从商业角度来看，这类制剂是产品生命周期管理的战略工具，有助于在竞争市场中区分产品，并可以降低药物研发过程中的风险。这些临床和商业优势凸显了HCMF在现代生物制药研究中的战略价值。尽管有这些优势，但使用超滤技术（如切向流过滤）浓缩生物制药蛋白时存在一个主要瓶颈，即高浓度引起的粘度、蛋白质自我聚集和聚集所带来的实际限制，表现为显著的反压、膜污染和过滤速率降低。粘度的增加归因于蛋白质间的相互作用（PPI），这种相互作用促进了长寿命、可逆的簇的形成，在溶液中形成了半永久性的网络（Dear et al., 2017, Zeng et al., 2021）。高粘度还会引起注射部位疼痛，并降低患者用药时的依从性（Huang et al., 2022）。此外，由于分子拥挤和单克隆抗体在超高浓度下的构象灵活性，分子间相互作用加剧，导致明显的浑浊、更高的聚集倾向和相分离（Armstrong et al., 2024, Meza et al., 2023, Yadav et al., 2010）。另一种常见的工业方法是首先填充低浓度蛋白溶液，然后进行冻干，再用少量溶液复溶以达到目标的高浓度。这种工艺简化了大规模生产并提高了操作便利性。冻干是一种有前景的策略，可以克服这些障碍，提高蛋白质的长期稳定性并减少运输过程中的物理应力（Fang et al., 2021）。然而，临床医生经常报告复溶时间过长和持续出现可见气泡（VBs），这会妨碍准确剂量控制，延迟给药，并降低工作效率和患者依从性（Gao et al., 2025a, Gao et al., 2024, Kulkarni et al., 2020, Kulkarni et al., 2021, Kulkarni et al., 2018）。延长的复溶时间还会增加产品暴露于环境条件的时间，从而增加潜在的质量风险。值得注意的是，Fang等人指出，塌陷的气泡可能会在依那西普制剂中引起局部加热和自由基生成，导致亚可见颗粒的形成——这揭示了一个非同寻常的蛋白质降解途径（Wang et al., 2014）。因此，虽然冻干在HCMFs的稳定性和物流方面具有明显优势，但仍需优化制剂和工艺以改善复溶性能并减少与粘度相关的问题。增强这些特性对于充分发挥高浓度蛋白药物的临床和商业潜力至关重要。

引言
作为天然氨基酸，精氨酸在多项研究中被报道为理想的蛋白液体制剂的辅料，可以有效减少相分离，降低粘度，并延长产品保质期（Emami et al., 2018, Hackl et al., 2018a, Ren, 2023, Srivastava et al., 2022）。精氨酸及其衍生物根据蛋白质种类、pH值和添加剂/蛋白质浓度的不同，可能会增强或抑制蛋白质聚集（Hada et al., 2023）。无定形状态的精氨酸盐酸盐可以直接防止蛋白质聚集，并在反复冻融循环中减少亚可见颗粒（Munjal et al., 2022）。此外，反离子的选择对精氨酸在液体制剂中的功能起着关键作用（Izutsu et al., 2005, Seifert et al., 2021, St?rtzel, 2018, Zhang et al., 2016）。已有研究表明，精氨酸盐酸盐作为冻干产品（含BSA或mAb）浓度≤50毫克/毫升的辅料时，与甘露醇或蔗糖组合使用可以降低残余水分含量，并有效抑制蛋白质聚集（Hackl et al., 2018a, Hackl et al., 2018b, St?rtzel et al., 2015a, St?rtzel et al., 2015b）。然而，关于精氨酸作为高浓度蛋白质复溶性质影响的报道相对较少，目前尚待探索。目前只有少数市售的冻干生物制药产品使用精氨酸作为辅料，例如Metalyse?（tenecteplase）和Bydureon BCise?（Exenatide Microspheres）（Gervasi et al., 2018）。精氨酸作为冻干辅料的应用受到限制，主要是因为其最大冷冻溶液的玻璃化转变温度（Tg‘）较低（-42.5°C）。这种低Tg‘在冻干过程中可能导致宏观和微观塌陷，从而增加最终产品的残余水分含量（St?rtzel et al., 2015a, St?rtzel et al., 2015b, St?rtzel et al., 2016）。此外，精氨酸的吸湿性使其即使在室温下也会吸收环境中的水分，这对蛋白质的不稳定性和聚集构成风险，正如在冻干BSA中观察到的那样，水分通过二硫键扰动导致聚集（Hackl et al., 2018a, Liu et al., 1991）。

为了回答上述问题并解决实际挑战，本研究采用了海藻糖、精氨酸盐酸盐和高浓度奥马珠单抗的组合，在冻干过程中利用mAb-海藻糖系统的高Tg‘来最大化抵消精氨酸盐酸盐的低Tg‘。研究目的是探讨不同比例的海藻糖、精氨酸盐酸盐和蛋白质对HCMFs的复溶性质、粘度和长期稳定性的影响，并通过分子动力学（MD）模拟阐明精氨酸调节PPIs的机制。选择奥马珠单抗作为模型蛋白质。研究了复溶过程中产生的VBs、复溶时间和冻干药饼内的微孔结构之间的关系。此外，还通过对不同mAb制剂中的精氨酸含量与制剂粘度之间的相关性进行了深入研究。此外，还通过尺寸排阻色谱（SEC）和离子交换色谱（IEC）在加速稳定性条件下监测和分析了蛋白质聚集的变化以及酸性和碱性变体的情况。

材料
奥马珠单抗（分子量约150 kDa）由浙江Bioray Biopharmaceutical Co. Ltd.（中国浙江）生产并慷慨提供。原始配方含有40.5毫克/毫升的蛋白质、29.1毫克/毫升的蔗糖和0.1毫克/毫升的聚山梨酯20，置于pH 6.0的5毫摩尔盐酸缓冲液中。L-精氨酸购自GPCSCI Co., Ltd（中国北京）。海藻糖购自Sinozyme Co., Ltd（中国南宁）。 vernier卡尺购自DEGUQMNT Co., Ltd（上海）。

冻干后，从每个配方批次（F1-F6）中随机选取代表性样品进行视觉检查，并记录其宏观外观（图1）。所有制剂的冻干药饼均表现出结构完整且均匀的形态。值得注意的是，在没有传统膨胀剂甘露醇的情况下，所有配方都出现了轻微收缩，但仍在可接受范围内。

讨论
海藻糖是一种传统的非还原性二糖辅料，因其抗结晶能力和高Tg而被用于冻干制剂中。相比之下，精氨酸的Tg相对较低，通常会在传统冻干过程中导致药饼塌陷。然而，在本研究中，高蛋白质浓度（60毫克/毫升）和海藻糖带来的高Tg共同作用，减轻了这种负面效应。

结论
本研究系统地研究了海藻糖和精氨酸作为冻干HCMFs复合辅料的协同效应和功能机制，并阐明了它们协同降低粘度的机制。海藻糖凭借其高玻璃化转变温度和抑制制剂成分结晶的能力，起到了主要的防冻保护作用，确保了冻干的可行性以及抗体的长期物理和化学稳定性。

声明
在撰写本手稿的过程中，作者使用了DeepSeek来辅助语言润色。随后，作者对内容进行了彻底审查和编辑，并对发表的工作承担全部责任。

作者贡献声明
Han Gao：撰写——原始草案、方法学、研究、数据分析。Cheng-Han Ye：监督、方法学。Jun Ouyang：撰写——审阅与编辑。Jia-Yi Lv：数据分析。Hongwen Li：方法学、软件、撰写——审阅与编辑。Ziqiao Sun：方法学。Tongyu Hang：方法学。Wei-Jie Fang：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取、数据分析。

利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本报告的工作。