人体皮肤冷冻储存对角质层药物渗透的影响：基于共焦拉曼光谱的定量研究

《International Journal of Pharmaceutics》：Effect of human skin storage on stratum corneum drug penetration assessed by confocal Raman spectroscopy

　　

新鲜人体皮肤是离体真皮渗透研究的首选模型。然而，其有限的可获得性常常需要冷冻储存。研究人员研究了在?20°C或?80°C下储存两个月是否影响皮肤屏障功能、选定的拉曼衍生皮肤特性及药物渗透。对于六名捐献者中的每一位，配对的全层腹部皮肤样本分别以新鲜状态或冷冻储存后进行分析。通过经皮水分散失（transepidermal water loss, TEWL）评估屏障完整性，同时使用定量共焦拉曼光谱（confocal Raman spectroscopy, CRS）测定在施加2%（w/w）水凝胶1小时后的水浓度分布以及咖啡因（caffeine, CAF）、双氯芬酸钠（diclofenac sodium, DIC）和水杨酸（salicylic acid, SA）在上层15 μm内的含量。经皮水分散失在不同储存条件下有所变化，但两种冷冻储存条件均与新鲜皮肤无显著差异。在?80°C储存后，拉曼衍生的水含量显著高于新鲜或?20°C储存的皮肤，而在指纹图谱或神经酰胺与脂肪酸联合信号中未检测到一致的储存相关差异。咖啡因的渗透量在新鲜皮肤、?20°C储存皮肤和?80°C储存皮肤中分别为18.57、19.82和21.51 μg/cm²，其中?80°C储存皮肤的渗透量显著高于新鲜皮肤。双氯芬酸钠和水杨酸未检测到显著差异。在这些条件下，?20°C储存未显著改变拉曼衍生的角质层参数或药物渗透结果，而?80°C储存改变了表层拉曼衍生的水信号和咖啡因渗透。因此，应针对每种化合物和实验终点标准化储存条件。

研究背景与目的：人类皮肤被广泛视为离体经皮渗透研究的最相关模型，而角质层（stratum corneum, SC）是外源物渗透的主要屏障。然而，新鲜人皮肤来源受限，常需冷冻储存；现有关于冷冻储存对皮肤渗透影响的证据并不一致，也缺乏针对定量共焦拉曼光谱（confocal Raman spectroscopy, CRS）在天然人皮肤中系统评估储存效应的研究。研究人员因此开展本研究，旨在探索捐献者匹配的全层人腹皮在?20°C或?80°C储存两个月后，是否影响皮肤屏障完整性、内源性SC性质及药物渗透。研究采用配对设计，可直接在同一捐献者内部比较不同储存条件，为冷冻储存方案的标准化提供方法学依据。

技术方法：研究人员采用离体人全层腹部皮肤，来源于6名匿名健康成人捐献者（男女兼有，年龄22–68岁），经伦理批准及知情同意。每例捐献者皮肤均分为新鲜、?20°C和?80°C三组，冷冻样本密封储存两个月。使用经皮水分散失（transepidermal water loss, TEWL）评估屏障完整性；使用定量CRS采集指纹区和高波数区拉曼光谱，计算水浓度分布及神经酰胺/脂肪酸联合信号；将2%咖啡因（caffeine, CAF）、双氯芬酸钠（diclofenac sodium, DIC）和水杨酸（salicylic acid, SA）的HEC水凝胶以5 mg/cm²的有限剂量施加1小时，定量上层15 μm内的药物量。统计分析采用单因素重复测量方差分析（ANOVA）及Holm校正配对比较。

研究结果：

3.1 储存条件对TEWL的影响：通过TEWL测量评估皮肤屏障。TEWL在储存条件下存在显著总体效应（F(2,10)=5.18, p=0.029），但Holm校正后任意两两比较均无显著差异；?80°C储存皮肤的TEWL均值最高，且超过10 g/m²/h的样本数量最多。该结果表明储存相关变异而非明确的屏障损伤。

3.2 深度分辨拉曼指纹光谱比较：比较未处理皮肤在2–16 μm深度的平均指纹光谱，所有储存条件下均检测到典型的蛋白和脂质相关谱带，未见储存特异性谱带出现或消失。各深度成对皮尔逊相关系数为0.844–0.995，其中4–10 μm相似度最高。但该比较基于供体平均光谱，仅描述整体谱形，不能排除细微分子组织变化。

3.3 储存条件对CRS水分布的影响：水含量随皮肤深度增加而升高。上层15 μm积分水含量在?80°C储存皮肤（819.68±46.83 μg/cm²）显著高于新鲜皮肤（686.30±39.72 μg/cm²）和?20°C储存皮肤（748.00±47.78 μg/cm²），而新鲜皮肤与?20°C储存皮肤无显著差异。这表明?80°C储存显著增加了浅表总水信号。

3.4 储存条件对神经酰胺和脂肪酸信号的影响：神经酰胺和脂肪酸联合信号随深度增加而下降，上层15 μm积分值在三种储存条件下相近，重复测量ANOVA未检测到显著储存效应（F(2,10)=0.75, p=0.496）。该单一组合信号不能全面反映SC脂质基质的分子组织和结构完整性。

3.5 冷冻储存对药物渗透的影响：CAF在上层15 μm的渗透量在?80°C储存皮肤（21.51±3.13 μg/cm²）显著高于新鲜皮肤（18.57±2.37 μg/cm²），而?20°C储存皮肤（19.82±3.71 μg/cm²）与新鲜皮肤无显著差异；DIC和SA在各储存条件间均无显著差异。浓度-深度曲线显示，冷冻样品在近表层浓度略有升高，而新鲜皮肤在更深层趋势略高。

3.6 储存相关渗透差异的解释：敏感性分析显示，将积分区间从0–10 μm扩展至0–20 μm时，CAF在?80°C储存皮肤中均显著高于新鲜皮肤，而DIC和SA在任何积分区间均无显著储存差异。该CAF结果与既往文献中?80°C储存可能增加亲水性化合物渗透的报道一致；但水合增加与CAF摄取同步升高并不能确定因果关系，且本方法未区分毛囊与细胞间通路。

3.7 与既往定量拉曼研究比较：本研究中CAF值与既往体内CRS报告约20 μg/cm²接近；SA值与既往体内研究报告的13.97–15.78 μg/cm²相近；DIC因既往研究采用相对信号强度而无法直接定量比较。这些相似性支持本定量结果的合理性。

3.8 局限性：仅考察了单一储存时长两个月，未监测皮肤实际冷却速率，无法区分初始冷却动力学与最终储存温度的影响；CRS端点未直接评估脂质有序度、蛋白质二级结构或组织形态；药物定量采用固定0–15 μm积分区间，未按个体SC厚度校正；同时，浅表水含量升高与CAF摄取增加之间的因果关系仍未解决。

讨论与结论：综合讨论指出，?20°C储存两个月在本研究的1小时有限剂量条件下未显著影响任何药物的定量CRS渗透结果，而?80°C储存显著增加了CAF渗透和浅表总水信号，可能反映冷冻导致的水合状态或微观结构改变。文章结论可概括为：在捐献者匹配的人皮肤中，?20°C储存两个月与新鲜皮肤相比未显著改变定量CRS药物量；?80°C储存显著增加了浅表15 μm内的CAF量，而DIC和SA无显著差异；?80°C储存的浅表总水信号显著高于新鲜及?20°C储存皮肤；TEWL存在总体储存效应而无显著配对差异；指纹谱主要谱带相似，神经酰胺/脂肪酸联合信号无显著储存效应；水含量和CAF摄取的平行增加并不能确证因果机制。因此，在基于定量CRS的渗透研究中，应针对每种化合物和实验终点专门评估储存效应，并建议标准化解冻与平衡流程，结合TEWL测量和基线浅表水合评估，将结果与捐献者匹配的新鲜组织或特定方案参照进行比较。