温度与粪肥尿素浓度对体外系统中气态氨产生速率的影响

《The Journal of Agricultural Science》：Effects of temperature and manure urea concentration on gaseous ammonia production rates in an in vitro system

　　

摘要专业翻译 畜牧粪便是农业气态氨（NH3）排放的主要来源，对环境和健康构成重大关切，尤其是在集约化畜牧舍饲系统中。本试验利用体外微室系统，研究了温度与粪肥尿素浓度对模拟牛粪NH3产生的影响。研究人员将新鲜牛粪与含有不同尿素浓度（0、5、12.5、20 g尿素-N/L）的模拟尿液混合，制备出尿素浓度分别为0、2.4、6.0和9.6 g尿素/kg的模拟粪肥。采用4×3因子随机区组设计，在三种温度（25、30和35 °C）下测试四种尿素处理，空气与粪肥温度保持一致，使用可控气流的微室系统。研究人员通过酸阱捕集和比色分析在90 min内测定氨浓度，并据此计算NH3产生速率。温度和尿素浓度均提高了NH3产生速率，尿素浓度与温度之间存在显著交互作用（P < 0.001）。与25 °C相比，30和35 °C在所有尿素浓度下均显著提高了NH3产生速率，估计增幅分别为3.9至5.2和7.5至10.0 mg NH3/m2/min。在25 °C下，各尿素处理间的NH3产生速率相近；而在30和35 °C下，从2.4至6.0 g尿素/kg粪肥时产生速率增加，但在9.6 g尿素/kg粪肥时几乎没有额外增加。添加尿素立即提高了粪肥pH（约增加1.2个单位），也提高了最终pH值。在所测试的范围内，温度对NH3产生速率的影响大于尿素浓度。

论文解读

一、研究背景与意义

农业气态氨（NH₃）排放是重要的环境问题，对空气质量、人类健康和生态系统均有不利影响。氨是一种刺激性气体，高浓度下可损害人和动物健康。在集约化畜牧舍饲系统中，舍内地面上粪肥的组成并不均匀，牛在活动时会搅动和混合尿液与粪便，但尿液在舍内粪肥上的分布因动物行为和排尿模式的不同而存在较大差异。这种空间变异导致粪肥不同区域的尿素浓度和脲酶活性不均，进而使同一舍饲系统内不同区域的NH₃产生速率差异显著，高排放热点往往出现在尿液沉积较多、粪肥表面局部尿素负荷较高的区域。准确理解这些变异对于预测NH₃排放和制定集约化养牛系统中有效的减缓策略至关重要。

当尿液中的尿素（CO(NH₂)₂）遇到粪便中的微生物脲酶时，会水解生成碳酸（H₂CO₃）和挥发性NH₃。尿素占奶牛尿液氮的69%，占绵羊尿液氮的83%，总氮范围为3.0至13.7 g N/L。由于脲酶是已知效率最高的酶之一，尿素酶促水解在25 °C下半衰期仅为20 ms。水解过程可描述为一系列后续反应，涉及NH₃/NH₄⁺与HCO₃^?/H₂CO₃之间的pH依赖性平衡。碱性条件有利于可挥发的NH₃形成，而酸性条件下则以NH₄⁺为主。

在密闭牛舍系统（包括牲畜出口船舶）中，NH₃挥发受空气温度、湿度、垫料、粪肥pH、饲养密度和换气速率等多种因素影响。对养牛作业的荟萃分析已确定空气温度是排放变异的主要驱动因素，NH₃排放随环境温度升高呈线性增加。在澳大利亚与北半球之间的牲畜运输航行中，牲畜可能暴露于超过30 °C的每日最高温度。本研究以25 °C为基准温度处理，代表粪肥表面化学平衡和传质参数通常被参数化的标准温度。25–35 °C的范围涵盖了一个生物学和物理学上相关的重要窗口，在此范围内温度驱动的NH₃挥发潜力变化可能十分显著。

日粮粗蛋白（CP）浓度影响尿氮排泄。例如，饲喂高CP日粮的泌乳奶牛氮摄入量可达585 g/天，其中188 g/天经粪便排出，231 g/天经尿液排出。对奶牛的一项综述发现，尿中氮排泄范围为3.0至20.5 g尿素-N/L，部分取决于日粮组成和氮摄入量。

本研究旨在评估温度对牛粪NH₃挥发速率的影响，同时检验粪肥中不同尿素浓度（尿素是尿液的主要氮源）对NH₃产生的影响。尿素浓度的变化被设计用于反映粪肥组成的空间异质性。本试验在受控体外系统中模拟温度和尿素浓度（模拟尿液）对牛粪NH₃产生的影响。研究假设为：（i）温度升高，NH₃产生速率增加；（ii）尿素浓度升高，NH₃产生速率增加；（iii）温度与尿素浓度对NH₃产生速率的联合效应不存在加性交互作用。同时评估温度和尿素浓度对添加尿素后粪肥初始pH、最终pH和NH₄⁺的影响。

二、研究设计与技术方法

本研究采用4×3因子随机区组设计，设四种粪肥处理（0、2.4、6.0和9.6 g尿素/kg模拟粪肥）和三种温度（25、30和35 °C）。试验在澳大利亚新英格兰大学（University of New England, Armidale）进行，为期4天。两头18月龄、约450 kg体重的婆罗门牛（Bos taurus）公牛单独圈养，饲喂100%商业船运颗粒日粮。每天从每头牛采集新鲜粪便样本，均质化后制备模拟粪肥。试验在3个不同日期重复进行，每天使用同一两头牛的新鲜粪便样本，每个尿素×温度组合设3个重复，共108个微室。微室由PVC管制成，配有螺纹盖和可调金属气体接头以控制气流，深度14.9 cm，直径8.7 cm，总体积886 cm³，添加粪肥后顶部空间体积为821 cm³。将60 g粪便与蒸馏水（对照组）或模拟尿液（尿素处理组）混合加入每个微室。模拟尿液通过将尿素溶解于超纯水中制备，浓度分别为5、12.5和20 g尿素-N/L，覆盖已报道的牛尿尿素浓度范围。根据平均日排泄量（4.8 L尿液和16.7 kg粪便，比例1:3.5），将模拟尿液与新鲜牛粪充分混合并调整至85%统一含水量，最终粪肥尿素浓度分别为0、2.4、6.0和9.6 g尿素/kg（湿重基准）。微室连接至酸阱（2%硼酸溶液，0.32 mol/L），空气经小型真空泵系统抽吸，气流速率设定为52次换气/小时（ACH），代表通风良好的牲畜出口船舶条件。NH₃产生量通过每10分钟采样酸阱共90分钟测定，硼酸样本采用基于Berthelot反应的比色板法分析，用分光光度计测定吸光度。粪肥和模拟粪肥样本按半固体粪肥的1:2稀释法测定pH。模拟粪肥样本用2 M KCl提取，同样采用Berthelot反应比色法测定铵态氮（NH₃和NH₄⁺）浓度。统计分析使用Stata软件进行，NH₃产生速率通过对每个微室的累积NH₃产生量随时间拟合最小二乘线性回归估计，以mg NH₃/m²/min表示。

三、研究结果

初始pH（添加尿素后立即测定）

将尿素掺入粪便后pH立即升高。预测平均增幅在各尿素浓度-温度组合间大致相似，但2.4 g尿素/kg粪肥处理的增幅较小，尤其在25 °C下（尿素浓度与温度交互作用的联合p值为0.002）。

NH₃产生速率

尿素浓度与温度之间存在显著交互作用（P < 0.001）。对照处理（0 g尿素/kg粪肥）在所有温度下均保持极低的NH₃产生速率（平均0.36 mg NH₃/m²/min；SD 0.23，无明显的温度趋势）。与对照相比，所有添加尿素的处理在所有温度下的NH₃产生速率均更高，且随温度升高增幅更大。在25 °C下，将尿素浓度从2.4提高至6.0和9.6 g/kg粪肥对NH₃产生速率影响甚微（估计差异分别为0.45和?0.21 mg NH₃/m²/min）；而在30和35 °C下，6.0和9.6 g/kg粪肥处理的产生速率相近（例如在30 °C下估计差异分别为0.98和1.09 mg NH₃/m²/min）。在35 °C下，6.0和9.6 g/kg粪肥处理的NH₃产生速率显著高于2.4 g/kg粪肥处理（估计差异分别为2.28和2.32 mg NH₃/m²/min；P = 0.013和P = 0.012）。在每个添加尿素的处理内，温度从25提高至30 °C以及从30提高至35 °C均导致NH₃产生速率显著增加（P < 0.001）。从30 °C起，升高空气和粪肥温度使NH₃产生速率增加约3.87至9.98 mg NH₃/m²/min。

最终pH

温度与尿素浓度对最终pH的联合效应存在交互作用（P < 0.001）。温度对最终pH的影响小于尿素浓度，预测平均值随温度范围近似线性变化。在0和2.4 g尿素/kg粪肥处理下，温度升高使最终pH略有下降（估计值分别下降0.16和0.14个单位），而在6.0和9.6 g处理下则略有升高（估计值分别升高0.10和0.11个pH单位）。添加尿素处理的最终pH预测平均值比对照处理高1.50至1.86个pH单位。

最终粪肥NH₄⁺浓度

温度与尿素浓度对最终粪肥NH₄⁺浓度的联合效应存在交互作用（P = 0.001）。粪肥NH₄⁺浓度随尿素浓度增加而升高，但在25和30 °C下较高尿素浓度时边际增幅递减，从2.4至6.0 g尿素/kg粪肥的NH₄⁺浓度估计均值增幅大于从6.0至9.6 g/kg粪肥的增幅。在2.4 g尿素/kg粪肥处理下，温度升高对粪肥NH₄⁺浓度影响不大，但在6.0至9.6 g尿素/kg粪肥处理下，粪肥NH₄⁺浓度随温度升高而下降。

四、讨论与结论

温度与尿素浓度在NH₃产生速率的联合效应上存在交互作用。在未添加尿素的对照处理中，温度升高几乎没有可测量的效应，因为收集的粪便中尿素含量极低，这表明仅靠温度升高在缺乏尿素的情况下不足以产生可观的NH₃。而当向模拟粪肥中添加尿素后，温度升高导致NH₃产生速率大幅增加，这与先前报道的尿素水解和NH₃产生速率随温度升高的研究结果一致。各处理内从25至30 °C和从30至35 °C的NH₃产生速率增幅相似，表明在本研究条件下温度效应的上限阈值高于35 °C。

尿素浓度本身的作用强烈依赖于温度。在25 °C下增加尿素浓度对NH₃产生速率影响甚微，表明在较凉爽条件下NH₃产生对额外尿素不敏感。而在35 °C下，NH₃产生速率从2.4至6.0 g尿素/kg粪肥时增加约2.3 mg NH₃/m²/min，但在6.0至9.6 g/kg粪肥之间无进一步增加。6.0 g尿素/kg粪肥以上产生速率相近，表明在本实验条件下NH₃产生接近上限。最高实验尿素浓度来自含20.0 g尿素-N/L的模拟尿液，接近奶牛尿液报道范围（3.0至20.5 g尿素-N/L）的上端。这表明在较高底物浓度下尿素水解受到限制，可能是由于活性脲酶位点饱和或其他传质过程在粪肥-空气界面的动力学限制，符合应用于粪肥表面的Michaelis-Menten动力学特征。

将尿素掺入粪便后pH立即升高，推测是由于粪肥脲酶催化尿素水解生成NH₃和碳酸，在溶液中解离为NH₄⁺和碳酸氢根离子，导致pH升高。pH向碱性方向移动使平衡偏向NH₃而非NH₄⁺，有利于NH₃挥发。额外尿素与相关pH升高共同为NH₃挥发创造了有利条件，尤其在较高温度下。

粪肥NH₄⁺浓度随添加尿素增加而升高，证实尿素水解正在发生，且部分添加的尿素-N以NH₄⁺形式保留在粪肥中。然而，在添加尿素的处理中，粪肥NH₄⁺浓度通常随温度升高而下降，尤其在6.0和9.6 g尿素/kg粪肥处理下。这种下降与较高温度下观察到的更高NH₃产生速率一致，温度升高使平衡从NH₄⁺向NH₃移动，导致粪肥中NH₄⁺保留减少和气态NH₃损失增加。

本研究结果应在受控体外系统的背景下解读，该系统采用52次换气/小时，代表通风良好的牲畜出口船舶。实验设计简化了商业畜牧环境的复杂性，其中粪肥组成的空间异质性、可变气流、水分动态和微生物活动等因素均影响NH₃产生。相对较短的测量周期捕捉的是早期NH₃挥发阶段而非长期动态，因此报道的NH₃产生速率应理解为受控条件下的短期速率。粪便总氮未测定，因此最终NH₄⁺浓度不能解释为初始氮的回收百分比或氮质量平衡。

研究结果支持了温度升高增加NH₃产生速率的假设，部分支持了尿素浓度升高增加NH₃产生速率的假设，因为尿素的作用依赖于温度，在35 °C下大于25和30 °C。无交互作用的假设未获支持，因为存在温度与尿素之间的交互作用证据。

结论：温度和尿素浓度交互影响牛粪NH₃产生速率，一旦添加尿素，温度成为所研究条件下最强的影响因素。增加尿素浓度在较高温度下提高了NH₃产生速率，但存在明显阈值，超过该阈值后额外尿素几乎不带来进一步增加，这与动力学或传质限制一致。总体而言，尿素可用性决定了NH₃产生速率的潜力，而温度则决定了该潜力被表达的程度。需要进一步研究确定这些关系如何在商业畜牧系统中转化，因为在这些系统中还有其他环境因素影响NH₃动态。