直接RAS抑制剂通过不同作用机制动态重塑KRAS互作组揭示趋同应答

《Oncogene》：Dynamic remodeling of the KRAS interactome by direct RAS inhibitors with distinct mechanism of action reveals convergent responses

　　

摘要专业翻译 KRAS在全部人类癌症中的突变率约为30%。靶向KRAS且具有不同作用机制（mechanism-of-action, MOA）及可变特异性（specificity）的小分子抑制剂已进入临床，但其对RAS信号网络的全面影响仍不明确。本研究利用邻近依赖性生物素鉴定（Proximity-dependent Biotin Identification, BioID）技术，描述了RAS抑制对KRAS互作组（interactome）的影响。研究使用了两种抑制剂：panRAS-ON，其与亲环蛋白（cyclophilin）及GTP结合状态的RAS形成三元复合物；panKRAS-off，其结合于KRAS的开关II（Switch II）口袋。研究发现，RAS抑制剂显著改变了KRAS邻近蛋白中16.5%的丰度。尽管两种抑制剂的作用模式截然不同，但它们诱导的KRAS互作组变化高度相关。在KRAS邻近蛋白中，Afadin（AFDN）受RAS抑制的影响最为显著。AFDN是细胞运动、侵袭和转移的关键调控因子。对AFDN磷酸化的分析显示，AKT仅部分调控p-Ser1718位点的磷酸化，而KRAS抑制则足以完全消除EGF介导的AFDN磷酸化。在KRAS驱动的非小细胞肺癌模型中沉默AFDN可消除趋化性，并破坏EGF驱动的伤口愈合模型中的定向迁移。研究证明，KRAS是调控生长因子诱导细胞迁移的核心节点，且KRAS抑制所发挥的作用远超MAPK介导的细胞增殖与存活调控范畴。

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一、研究背景与科学问题

KRAS是关键的信号转导蛋白，通过招募多种效应蛋白将胞外信号传递至下游通路。在经典模型中，处于GTP结合活化状态的KRAS直接与效应蛋白（如RAF激酶和PI3K）相互作用，触发包括丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）和PI3K在内的下游信号通路。KRAS固有的GTP水解活性以及GTP酶激活蛋白（GTPase-activating proteins, GAPs）的调控作用共同促进GTP水解，使活化的KRAS转变为非活性的GDP结合形式，从而确保正常细胞中KRAS介导的信号级联被精确调控。

KRAS突变发生于约31.2%的人类癌症中，尤其在三种致死率最高的癌症类型中比例极高（胰腺癌78.7%、结直肠癌49.7%、肺癌20.1%）。突变型KRAS因内在GTP酶功能受损及对GAP负调控的敏感性降低，持续处于GTP结合的活化状态，导致促肿瘤信号通路的组成性激活。尽管KRAS曾被视为“不可成药”靶点，目前已有两种靶向KRAS^G12C的疗法获FDA批准，更多药物处于临床开发阶段。然而，许多患者对单药治疗存在原发性或获得性耐药。因此，深入了解KRAS信号网络及其互作组，有助于发现新的治疗靶点、提出联合治疗策略并理解耐药机制。

二、研究目的与主要发现

本研究旨在利用TurboID偶联的邻近依赖性生物素鉴定（BioID）技术，在KRAS^G12C突变非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）H358细胞中系统绘制KRAS互作组图谱，并通过两种作用机制截然不同的临床相关RAS抑制剂（RASi）——panRAS-ON（与亲环蛋白A形成三元复合物，阻断GTP-KRAS效应界面）和panKRAS-off（非共价结合GDP-KRAS开关II口袋）——评估药理学扰动对KRAS互作组的动态影响。研究得出以下核心结论：两种机制不同的RAS抑制剂诱导了高度相关的KRAS互作组变化，提示将KRAS锁定于非活性GDP状态与直接封闭活性GTP-KRAS的结合表面在功能上等效；Afadin（AFDN）是受RAS抑制影响最显著的KRAS邻近蛋白，KRAS是EGF诱导的AFDN^S1718磷酸化的主要上游调控因子；KRAS-AFDN信号轴是调控细胞迁移方向性和极性的关键介质。这些发现揭示了KRAS抑制除MAPK介导的增殖与存活调控之外的更广泛功能角色。

三、关键技术方法

研究人员主要采用了以下核心技术手段：TurboID邻近标记偶联定量蛋白质组学（BioID），在KRAS^G12C突变NSCLC细胞系H358中稳定表达N端融合FLAG-TurboID的六种KRAS变体（KRAS4A^wt、KRAS4A^G12D、KRAS4A^G12V、KRAS4B^wt、KRAS4B^G12D、KRAS4B^G12V），结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定生物素化蛋白；免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, co-IP）验证KRAS-AFDN直接相互作用；自动化毛细管免疫印迹（Jess系统）检测信号通路蛋白磷酸化水平；短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）介导的AFDN基因沉默及RA1/2结构域缺失突变体（RA?AFDN）回补实验；活细胞高内涵成像结合单细胞追踪分析（Cellpose分割、ilastik追踪）评估细胞运动行为；Transwell趋化迁移实验和Matrigel侵袭实验验证细胞迁移与侵袭能力。

四、研究结果

BioID构建肺癌中全面的KRAS互作组

研究人员在H358细胞中检测到3305种生物素化蛋白，其中867种与BioGRID数据库中1290种已知KRAS互作因子重叠（覆盖率67%）。经严格统计筛选（log2FC>1或

药理学抑制诱导KRAS互作组的动态重塑

在544种RASi敏感蛋白中，256种（47.1%）在两种RASi处理后与KRAS邻近性显著降低，203种（37.3%）显著升高。经典效应蛋白如RAF1、RASSF5、BRAF被一致性地从KRAS邻近区域驱逐。上调蛋白中67.5%出现在24小时处理组，而下调蛋白中仅30.1%出现在24小时组，提示KRAS互作组对药理学抑制的急性应答（8小时）与长期应答（24小时）存在本质差异。ERBB2和ERBB3的邻近性升高被证实源于MAPK通路抑制后的代偿性表达上调，而非直接结合亲和力改变。

机制不同的RAS抑制剂影响相同的KRAS蛋白互作组

将panRAS-ON与panKRAS-off诱导的各蛋白丰度变化进行相关性分析，发现两种抑制剂在所有KRAS等位基因背景下均诱导高度正相关的互作组变化。相比之下，同一处理条件下8小时与24小时之间的相关性，以及KRAS4A与KRAS4B互作组之间的相关性均较弱。KRAS4A与KRAS4B在8小时处理时仅有16.7%的RASi敏感互作因子重叠，24小时时下调蛋白重叠率升至38.0%、上调蛋白为29.3%，表明两种剪接变体对长期KRAS抑制的代偿性反馈应答具有更高相似性。

AFDN与致癌KRAS突变体相关联

AFDN是BioID中受RASi影响最显著的KRAS邻近蛋白之一，其被驱逐的显著性与经典效应蛋白BRAF和CRAF相当。KRAS^G12D或KRAS^G12V转导的H358细胞中AFDN在KRAS邻近的基础丰度高于野生型KRAS表达细胞，提示AFDN对GTP结合活性KRAS的亲和力高于GDP结合非活性KRAS。免疫共沉淀实验独立证实，panRAS-ON和panKRAS-off处理均可消除KRAS^G12V与AFDN的共沉淀。

KRAS介导EGF刺激的AFDN磷酸化

EGF刺激可显著诱导H358细胞中AFDN^S1718磷酸化，其峰值时间与p-AKT一致（5分钟），早于p-ERK峰值（10分钟）。两种RASi均可剂量依赖性地完全抑制p-AFDN^S1718和p-AKT，而p-ERK仅被部分抑制。抑制剂对比实验显示，三种KRAS抑制剂（panRAS-ON、panKRAS-off、sotorasib）均完全阻断EGF诱导的AFDN^S1718磷酸化，而泛AKT抑制剂MK2206仅部分降低其水平，MEK抑制剂trametinib仅影响p-ERK。RA1/2结构域缺失的AFDN片段（RA?AFDN）回补实验表明，该磷酸化事件不依赖KRAS-AFDN直接结合。

AFDN依赖性定向细胞迁移

低剂量RASi可在不引起明显细胞毒性的情况下完全抑制细胞运动速度，且运动抑制发生在MAPK信号完全阻断之前，表明KRAS对迁移的调控独立于增殖。伤口愈合实验的单细胞追踪显示，AFDN沉默并不损害细胞运动能力，反而增加了EGF刺激下的总迁移距离，但显著降低了迁移方向性——AFDN缺失细胞的运动轨迹类似布朗运动，其净距离、前向迁移指数（forward migration index, FMI）和蜿蜒指数（meandering index）均显著低于亲本细胞。Transwell趋化实验证实，AFDN沉默完全消除了H358和H441细胞中FBS驱动的趋化迁移，而Matrigel侵袭实验显示AFDN缺失不影响侵袭能力。

五、讨论与结论

本研究通过TurboID-BioID技术在KRAS驱动的NSCLC模型中构建了时间分辨且疾病相关的KRAS互作组，显著扩展了KRAS调控网络。两种机制不同的RASi诱导高度相关的互作组变化，表明将KRAS锁定于非活性状态与直接封闭活性GTP-KRAS效应界面在功能上等效。研究同时识别出RASi敏感和RASi不敏感的KRAS互作因子——GEFs（如SOS1）在RASi处理后仍保持KRAS邻近性，可能因支架蛋白介导的间接关联所致。AFDN被确认为KRAS下游调控EGF诱导细胞迁移方向性的关键介质，KRAS抑制可完全阻断AFDN^S1718磷酸化，而AKT仅部分参与该事件，提示存在AKT之外的KRAS下游激酶参与调控。AFDN在癌症迁移中的功能具有背景依赖性，不同实验方法（Transwell趋化、伤口愈合、Matrigel侵袭）分别反映迁移的不同侧面。研究结论表明，KRAS是调控生长因子诱导细胞迁移的核心节点，KRAS-AFDN信号轴在介导细胞迁移方向性和极性中发挥关键作用，KRAS抑制的治疗效应远超MAPK介导的增殖与存活调控范畴，为KRAS靶向治疗提供了更广阔的机制理解。

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