系统性评估类风湿关节炎相关人成纤维样滑膜细胞与淋巴结基质细胞中RT-qPCR参考基因的表达稳定性

《Scientific Reports》：Identification of stable reference genes for quantitative real-time PCR in human fibroblasts from lymph nodes and synovium

　　

摘要

实时定量PCR（RT-qPCR）是基因表达分析中广泛使用的一种方法；然而，其准确性取决于稳定参考基因的选择以实现归一化。迄今为止，尽管这些基质细胞在疾病发病机制中起着关键作用，但仍无研究系统鉴定类风湿关节炎（RA）背景下原代人成纤维样滑膜细胞（FLS）和淋巴结基质细胞（LNSCs）的合适参考基因。我们评估了12个候选参考基因在经受各种体外条件（包括炎症刺激、衰老诱导和分化）的FLS和LNSCs中的表达稳定性。候选基因基于常见使用情况和公开转录组数据集的Genevestigator分析进行选择。使用Clarida和RefFinder软件评估表达稳定性，整合了geNorm、NormFinder、BestKeeper和比较delta Ct方法。推荐参考基因的数量和身份取决于细胞类型和实验条件。在LNSCs中，两个基因RPLP0和POLR2G在所有测试条件下均被推荐。相比之下，FLS表现出条件依赖性变异，未处理的FLS推荐POLR2G和TBP。相比之下，对经受TNFαLTαβ刺激的FLS推荐三个基因的组合（EEF1A1、NFIC和POLR2A），对衰老相关条件推荐三个基因的组合（EEF1A1、GAPDH和NFIC)，对脂肪生成推荐三个基因的组合（POLR2G、EEF1A1和TBP)。未处理FLS中归一化策略的比较显示，参考基因的选择影响了相对目标基因表达模式及其解释。本研究首次系统评估了人FLS和LNSCs中RT-qPCR归一化的参考基因。我们的发现强调了参考基因的条件和细胞类型特异性验证的必要性，以确保成纤维细胞生物学和炎症疾病研究中基因表达分析的准确性和可重复性。