cPRIME（prime editing with cDNA readout）实现内源性遗传变异在RNA水平效应的系统映射并揭示同义标记编辑对RNA加工的影响

《Nature Communications》：cPRIME enables endogenous mapping of genetic variant effects at RNA level

　　

理解遗传变异的功能后果，尤其是被归类为意义未明变异（variants of uncertain significance，VUS）的变异，是基因组学中的一项主要挑战。尽管变异在蛋白质水平的影响已被广泛认识，其在转录后调控中的作用日益受到重视。在此，研究人员介绍cPRIME（prime editing with cDNA readout，先导编辑与cDNA读出），一种用于在RNA水平评估变异效应的可扩展方法。cPRIME利用先导编辑（prime editing）将遗传变异插入内源性基因组位点，随后定量RNA（cDNA）和基因组DNA（gDNA）水平变异频率的变化。研究人员在多种核型和基因组位点中证明其有效性，并揭示同义标记编辑（synonymous marker edits）——常用于先导编辑筛选——其本身可改变RNA加工，从而混淆对变异效应的解释。综上，cPRIME提供了一个在基因组背景下研究遗传变异转录后后果的平台，并建立了在癌症和其他疾病中对改变RNA的变异进行功能解读的框架。

研究背景与意义：随着下一代测序（next-generation sequencing，NGS）技术发展，遗传变异可被高通量识别，但大量VUS的功能后果仍未知。除无义变异可引入提前终止密码子并通常破坏蛋白功能外，同义变异及非编码区变异，如内含子和非翻译区（untranslated region，UTR）变异，也可通过影响RNA加工与稳定性产生功能效应。已有MPRA（Massively Parallel Reporter Assays）虽可规模化检测变异，但将变异置于报告构建体中，缺乏内源性基因组背景；SGE（Saturation Genome Editing）可在基因组背景中评估变异，却依赖同源定向修复（homology-directed repair，HDR），在多种细胞中效率低，且每个约200 bp基因组区域需独立供体文库。因而，研究人员开发cPRIME，以先导编辑将变异引入内源性基因座，并通过cDNA与gDNA中变异频率比值评估RNA水平效应。该研究发表于《Nature Communications》，其意义在于提供研究遗传变异转录后后果的平台，并建立癌症和其他疾病中RNA改变变异的功能解读框架。

关键技术方法概述（≤250字）：研究人员使用近单倍体KBM7和近三倍体K562慢性髓性白血病细胞系，建立稳定表达prime editor（nCas9-RT，PE2，如Anzalone et al.描述）的细胞，并敲除MLH1升级为PE4。采用pooled pegRNA文库靶向NF1多个外显子，慢病毒转导后进行编辑，分别扩增gDNA和cDNA并进行NGS定量，以reads per million（RPM）计算编辑频率和cDNA/gDNA比值即cPRIME score。变异来源包括cBioPortal与ClinVar。分析中使用Pangolin和SpliceAI预测剪接，deepSRAMP预测N⁶-甲基腺苷（m⁶A），ROC分析ClinVar注释，高斯混合模型（Gaussian mixture model，GMM）进行无监督分类。

研究结果：
Synonymous marker edits enable the detection of rare prime editing events（同义标记编辑使罕见prime editing事件可检测）：研究人员在NF1外显子27池化先导编辑筛选中，将同义标记编辑置于目标单核苷酸变异（single-nucleotide variant，SNV）旁。未编辑对照中，编辑水平背景频率为KBM7 0.037±0.041%、K562 0.045±0.049%；联合编辑-标记单倍型背景低约1280倍（KBM7）和1120倍（K562），使近90%变异可高于背景定量，而无标记编辑时仅约10%的SNV可定量。结论是同义标记编辑提高罕见编辑事件检测准确性。

Prime editing frequencies are highly variable across target sites（prime editing频率在靶位点间高度可变）：使用NF1外显子27文库进行筛选，pegRNA文库分布窄，但编辑频率在KBM7和K562中跨数个数量级。98个预期编辑中，69%（KBM7）和76%（K562）可在高于10 RPM阈值检测。编辑效率具靶位点特异性且跨细胞系一致。pegRNA序列中>4个连续胸腺嘧啶及20 nt spacer序列影响效率。结论是poly-T和spacer是prime editing效率的重要决定因素。

cPRIME enables the systematic mapping of variant effects at RNA level（cPRIME实现RNA水平变异效应系统映射）：研究人员同时测定gDNA和cDNA编辑频率。gDNA与cDNA编辑频率总体强相关。所有无义（STOP）变异cDNA RPM低于gDNA，符合无义介导降解（nonsense-mediated decay，NMD）；其cPRIME score<1，KBM7平均0.19±0.06，K562平均0.30±0.03。多数非STOP变异cPRIME score接近1，但E1206E_A > G、R1207R_G > A和D1217E_A > G在两细胞系持续<1。Pangolin预测这三个非STOP变异剪接增益>0.5，提示隐蔽剪接位点激活。结论是cPRIME可检测影响RNA剪接和丰度的变异。

Synonymous marker edits can influence RNA processing（同义标记编辑可影响RNA加工）：阵列验证与筛选cPRIME score高度相关。去除同义标记后，三个非STOP变异中仅D1217E_A > G仍降低cDNA，但程度弱于联合标记；E1206E_A > G的Pangolin剪接增益完全消失，R1207R_G > A部分消失。R1207R_G > A单独引入不降低cPRIME score，以C或T替换标记位置也不降低；仅原始变异-标记组合具强预测剪接增益。结论是某些精确变异-标记组合可通过引入新剪接基序显著影响RNA加工，未来pegRNA文库设计应纳入剪接预测过滤。

cPRIME enables simultaneous analysis of multiple genomic loci（cPRIME可同时分析多个基因组位点）：研究人员用单一pegRNA文库同时靶向NF1外显子17、25、34、39、42及27，包含341个pegRNA、178个预期编辑。KBM7与K562 cPRIME score高度重复，Pearson r=0.91；外显子27在原筛选和多外显子筛选中r=0.96。高于阈值编辑比例7.3%–38%。STOP变异一致显示cPRIME score<1。A1071E_G > A和A1071V_G > A在两细胞系显著升高，deepSRAMP预测其m⁶A位点概率增加。Pangolin高增益变异与cPRIME降低一致，中增益变异可变，低增益变异多接近1。SpliceAI与Pangolin评分强相关（r=0.93）。结论是cPRIME可扩展至多基因座，并与剪接预测互补；设计时应过滤同义标记诱导的剪接效应。

cPRIME distinguishes ClinVar pathogenic NF1 variants associated with altered RNA（cPRIME区分与RNA改变相关的ClinVar致病NF1变异）：研究人员将多外显子筛选结果与ClinVar致病性注释比较。ROC分析显示，cPRIME score可区分致病/可能致病与良性/可能良性变异，AUC=1.0（每个细胞系3个致病、17个良性），该金标准集较小，作为概念验证。致病/可能致病变异显示低cPRIME score，良性/可能良性多接近1，VUS分布广泛。结论是cPRIME可为临床注释NF1变异提供功能信息并优先关注潜在RNA水平效应VUS。

Gaussian mixture model to classify NF1 variants by RNA-level effects（高斯混合模型按RNA水平效应分类NF1变异）：研究人员对log₁₀转换cPRIME score拟合三组分GMM，分为RNA-depleted、RNA-intermediate和RNA-neutral。KBM7中46个RNA-neutral、17个RNA-intermediate、7个RNA-depleted；K562中44个RNA-neutral、11个RNA-intermediate、7个RNA-depleted。RNA-depleted富集于Pangolin高增益；stop-gained多归为RNA-depleted或RNA-intermediate，同义变异多归为RNA-neutral；良性/可能良性归为RNA-neutral，RNA-depleted包括致病/可能致病及缺乏ClinVar分类变异。结论是cPRIME score可识别与RNA水平改变相关的遗传变异。

讨论与结论：cPRIME基于cDNA与gDNA变异表示比较，原理类似SGE，但以prime editing替代HDR介导的变异安装，无需SGE所需的位点特异DNA供体模板池，从而可用单一pegRNA文库在多基因组位点安装变异，同时保留天然基因组和RNA加工背景，也不像MPRA脱离内源背景。研究表明cPRIME可在不同核型和基因组位点检测RNA水平变化，STOP变异符合NMD，预测剪接改变变异可被检测。研究还提示同义标记编辑不应默认中性，因其改变RNA序列并可引入或修饰剪接相关基序，未来文库应进行剪接感知计算过滤并尽可能采用多个独立标记设计。cPRIME适合作为定量筛选方法，优先识别具RNA水平效应的变异以供机制随访；后续可用isoform-specific RT-PCR、长读长转录测序或RNA衰减通路扰动明确机制。当前cPRIME依赖靶向扩增子测序，限制于可设计合适gDNA和cDNA扩增子的区域，长转录本或复杂isoform可能需区域特异策略。prime editing效率仍低且靶位点变异大，决定覆盖需求；多外显子筛选中阈值以上变异比例为7.3%–38%，尽管每pegRNA覆盖35,000细胞。改进pegRNA设计和PE7、PE8等新一代prime editor有望提高效率并降低覆盖需求。ClinVar比较虽小但方向一致。cPRIME并非通用致病性分类器，而是补充以蛋白为中心的功能检测。研究结论翻译：综上，cPRIME提供了一个优先考虑改变RNA的变异并支持癌症和其他遗传疾病中遗传变异功能解读的框架。