自然杀伤细胞疗法的下一代演进：从基础研究到临床转化及超越的系统级工程策略

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Next-generation natural killer cell therapy: bench to bedside and beyond

　　

中文摘要翻译 自然杀伤（NK）细胞已成为癌症免疫治疗的核心参与者，在五十年的时间里从基础发现进展为临床验证的平台。本综述综合了NK细胞生物学不断演进的认识，包括亚群异质性、表观遗传调控和代谢控制，并作为创新焦点，探讨了瘤内NK细胞异质性、表观遗传调节和胞内免疫检查点，为合理的治疗工程化奠定基础。我们审视了从未经修饰的过继转移，到细胞因子诱导的记忆样NK细胞，再到最具变革性的嵌合抗原受体（CAR）-NK细胞的临床轨迹。里程碑式试验已确立了CAR-NK细胞在B细胞恶性肿瘤中的显著疗效和优越安全性，近期研究进一步将这些获益扩展到系统性红斑狼疮和系统性硬化症等自身免疫性疾病，展示了持久的免疫重置和良好的安全性特征。尽管取得了这些进展，实体瘤仍是艰巨的挑战，受到抗原异质性、物理屏障和代谢不利微环境的阻碍。因此，我们分析了超越单一修饰、迈向系统级重编程的下一代工程化策略，涵盖内在增强（细胞因子信号、代谢适应性、检查点破坏）、外在肿瘤微环境重塑以及先进递送平台。我们进一步通过系统性地审视指导精准NK细胞治疗路径的关键优化参数，综合了临床转化的实践维度，这些参数包括合理的剂量和给药方案、降低淋巴细胞清除强度的策略、不同疾病适应症中依赖情境的持久性要求，以及新兴的生物标志物格局。

论文主体内容总结

临床转化：从首次试验到CAR-NK突破的二十年进展

NK细胞于1975年被首次描述为无需预先致敏即可裂解癌细胞的大颗粒淋巴细胞。2003年启动了首个NK细胞治疗临床试验（NCT00089453），标志着免疫治疗新时代的开始。2005年，基于NK-92细胞体外扩增和抗肿瘤活性的研究，启动了NK-92细胞输注治疗自体干细胞移植后复发血液系统恶性肿瘤的剂量递增临床试验（NCT00990717）。Bachanova等人采用IL-2白喉毒素融合蛋白增强半相合NK细胞治疗急性髓系白血病（AML）的II期临床试验。2008年，细胞因子诱导的记忆样（CIML）NK细胞首次应用于肝细胞癌（HCC）治疗（NCT00769106）。同年起，NK细胞治疗与单克隆抗体（包括利妥昔单抗和西妥昔单抗）联合策略的临床试验不断增加。2011年，Cooley等人启动了重组人IL-15联合异基因NK细胞治疗晚期AML的首次临床试验。2013年，Vela等人设计了挽救性化疗联合异基因IL-15/4-1BBL激活NK细胞输注的临床试验，在儿童复发/难治性白血病中实现72%的完全缓解（CR）率。同年，首个采用mRNA电穿孔工程化的靶向CD19 CAR-NK细胞治疗B细胞恶性肿瘤的临床试验启动（NCT01974479）。2017年，Liu等人开展了CAR-NK细胞治疗复发/难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）的首个里程碑式临床试验，37例患者中总缓解率（ORR）为48.6%，1年总生存（OS）和无进展生存（PFS）率分别为68%和32%。2021年，Huang等人开展了CD33靶向CAR-NK细胞治疗复发/难治性AML的I期临床试验；同年Li等人报道了NKG2D CAR-NK细胞腹腔输注治疗晚期结直肠癌的I期临床试验。2022年，研究团队开发了脐带血（UCB）来源的CD19特异性CAR-NK细胞治疗复发/难治性大B细胞淋巴瘤，第30天ORR为62.5%，其中50%达到CR。2023年，CAR-NK细胞治疗首次应用于系统性红斑狼疮（SLE）（NCT06010472）。最近，Ghobadi等人报道了诱导多能干细胞（iPSC）来源的CD19靶向CAR-NK细胞治疗（FT596）在复发或难治性B细胞淋巴瘤患者（n=86）中首个完成的I期试验，治疗耐受性良好，无剂量限制性毒性，未达到最大耐受剂量，仅观察到低级别细胞因子释放综合征（CRS）（13%；均为≤2级），无神经毒性或移植物抗宿主病（GVHD），滤泡性淋巴瘤中ORR达100%、CR率达85%。

NK细胞生物学：发育、亚群和组织驻留

发育与成熟

NK细胞由造血干细胞（HSCs）经CD38?CD7?CD10?CD127?共同淋巴祖细胞（CLPs）发育而来，CD122的获得标志着不可逆的谱系定向。共同髓系祖细胞（CMPs）和粒细胞-单核细胞祖细胞（GMPs）在支持性条件下也可生成NK细胞。NK细胞现被认定为固有淋巴样细胞（ILCs）的一个亚群。早期NK祖细胞（ENKPs）生成传统细胞毒性NK细胞，而ILC祖细胞（ILCPs）在组织信号依赖方式下贡献于辅助样ILC谱系。关键转录因子包括ID2、RUNX3和NFIL3（早期特化）以及T-bet/EOMES（晚期成熟和细胞毒性）。IL-15通过异三聚体IL-15受体复合物（IL-15Rα、CD122和共同γ链（γc））信号传导，调控NK细胞存活、增殖和功能成熟。

NK细胞亚群分类和记忆样表型

传统分类将成熟NK细胞分为CD56^brightCD16^?免疫调节细胞和CD56^dimCD16⁺细胞毒性效应细胞，CD57标记具有更强杀伤能力的终末成熟亚群。单细胞技术进一步鉴定了三种主要NK细胞亚群（NK1细胞毒性效应细胞、NK2免疫调节细胞、NK3适应性细胞），可细分为六个具有独特分子特征、功能特化和代谢谱的亚组。适应性NK细胞可由巨细胞病毒（CMV）暴露或细胞因子诱导产生，以NKG2C、CD57和颗粒酶H为标志，缺乏PLZF、FcεRγ、EAT-2和SYK等信号分子。在肿瘤微环境（TME）中，肿瘤相关NK细胞（TaNKs）呈现以KLF6、EGR3和NR4A1高表达为特征的功能障碍状态。

效应功能

激活的NK细胞通过穿孔素/颗粒酶介导的细胞毒性、经CD16的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）以及死亡受体途径（FasL/TRAIL）消除靶细胞，以非主要组织相容性复合体（MHC）限制方式发生，无需预先抗原呈递。

迁移和组织驻留

NK细胞转运受整合素、选择素、趋化因子、细胞因子诱导信号、1-磷酸鞘氨醇和细胞微环境控制。CD56^dimCD16⁺ NK细胞主要循环于血液、骨髓、脾脏和肺，而CD56^brightCD16^?细胞定位于淋巴结和肠道。组织驻留NK细胞（trNKs）表达CD69和更具特异性的标志物RGS1。蜕膜NK（dNK）细胞是典型的trNK亚群，获得CD56^brightCD16^?CD49a⁺CD9⁺EOMES⁺CD69⁺驻留表型，调控滋养层侵袭、血管重塑和母胎耐受。

代谢调控

静息NK细胞依赖氧化磷酸化（OXPHOS）；激活后上调有氧糖酵解。激活的NK细胞将葡萄糖来源的丙酮酸改道进入柠檬酸-苹果酸穿梭，甾醇调节元件结合蛋白（SREBP）是不可或缺的守门人。IL-2、IL-12和IL-15通过mTOR信号通路增强糖酵解和OXPHOS。转化生长因子-β（TGF-β）通过诱导FBP1并抑制c-MYC和mTOR信号抑制糖酵解和线粒体代谢。TME中乳酸积累诱导ROCK1等蛋白的赖氨酸乳酰化（Kla），导致线粒体碎片化和功能损伤，可通过NAD?前体与SIRT3激活剂联合逆转。

分子机制：受体信号、整合和检查点

激活与抑制受体的平衡

NK细胞表达大量种系编码的激活性和抑制性受体。激活性受体包括MHC I类特异性受体（激活性杀伤免疫球蛋白样受体（aKIRs），如KIR2DS、KIR3DS）和非MHC I类特异性受体（CD16、自然细胞毒性受体（NCRs；NKp30、NKp44、NKp46）、NKG2C/CD94、NKG2D、DNAM-1、NKp80和NTB-A）。aKIRs通过DAP12衔接蛋白胞质域内免疫受体酪氨酸激活基序（ITAMs）的磷酸化传导激活信号。抑制性受体包括iKIRs（如KIR2DL、KIR3DL）和NKG2A/CD94、NKR-P1A、Siglec-7、LAIR-1和IRp60等，其胞质尾部含免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIMs），磷酸化后招募含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1（SHP1）、SHP2和含SH2结构域的肌醇-5-磷酸酶（SHIP）传导抑制信号。

细胞因子和共刺激信号

关键促激活细胞因子包括IL-1β、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IL-33，其中IL-15被认为是调控NK细胞整个生命周期的最关键细胞因子。CISH是IL-15信号的负调控因子。剪接型X盒结合蛋白1（XBP1s）是IL-15-AKT信号下游的关键转录因子，促进T-bet招募至GZMB和IFNG基因座。IL-12主要通过STAT4实施多管齐下的转录程序。TGF-β下调激活性受体并抑制穿孔素和颗粒酶B。共刺激受体包括SLAM家族受体和肿瘤坏死因子受体超家族成员，共刺激结构域是CAR的必要组成。

细胞教育和自身耐受

NK细胞发育过程中经历"教育"过程，在与自身MHC I类配体结合后获得功能能力和自身耐受。NKG2A/CD94识别非经典HLA-E。当靶细胞下调或缺失MHC I类分子时，变得易受NK细胞介导的裂解，即"缺失自我识别"。NK细胞介导的细胞毒性也可由"诱导自我识别"启动，即应激诱导或病原体来源配体的上调或从头表达。

NK细胞中的免疫检查点途径

TaNKs表达的免疫检查点包括抑制性KIR、NKG2A、PD-1、TIM-3、LAG-3、CTLA-4和TIGIT，以及IGSF8、IL-1R8和GPR132。最近鉴定的CLEC12B是含ITIM的C型凝集素受体，在HCC中限制NK细胞抗肿瘤免疫，其与肿瘤表面锚定的脂蛋白脂肪酶（LPL）结合触发SHP-1介导的SYK-PI3K-AKT-S6信号轴抑制。胞内检查点包括CIS、TIPE2、Cbl-b、EZH2、FBP1、HIF-1α和BIM。新近发现的胞内检查点包括CREM（IL-15和CAR信号下游的关键转录检查点）、SYK（负调控ITAM介导信号）、BCL9（经GATA1介导的NOTCH-IL-18R1信号抑制NK功能）、EAT-2（使NK细胞对SLAM相关受体信号低反应）、SMAD4（介导TGFβ/激活素A信号）、SAMSN1（抑制NK激活、增殖和颗粒酶B产生）。全基因组CRISPR筛选系统揭示了MED12、CCNC和ARIH2等新型胞内检查点。

效应阶段：靶细胞杀伤的动力学和机制

NK细胞接触靶细胞后在界面形成免疫突触，涉及表面受体、信号蛋白的动态空间组织和微管组织中心（MTOC）极化，促进定向裂解颗粒释放和死亡受体-配体相互作用。裂解颗粒含有穿孔素和激活procaspases的颗粒酶。NK细胞表面呈递FasL或TRAIL，分别与靶细胞上的Fas和TRAIL-R1/R2结合。颗粒介导杀伤触发快速细胞毒性，随后是较慢的死亡受体介导凋亡。连续杀伤过程中，后续杀伤事件更快，NK细胞从初始杀伤事件中快速的颗粒酶介导细胞死亡切换至后续肿瘤细胞遭遇中较慢的死亡受体介导杀伤。

NK细胞可塑性和功能的表观遗传及转录后调控

NK细胞可塑性受表观遗传机制根本性塑造。感染驱动的NK向ILC1样转化伴随EOMES下调和广泛染色质重塑。在TGF-β丰富的TME中，这种可塑性可驱动NK细胞向ILC1样状态转化，减弱细胞毒性并促进肿瘤免疫逃逸。表观遗传主要机制包括（1）DNA甲基化，（2）组蛋白修饰，（3）RNA甲基化（表观转录组学），以及（4）非编码RNA（ncRNAs）调控，如微小RNA（miRNAs）、长链非编码RNA（lncRNAs）和环状RNA（circRNAs）。

DNA甲基化：NK细胞发育和命运决定的调控

DNA甲基化由DNA甲基转移酶（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B）和去甲基化酶（TET2）动态调控。NK细胞获得完全效应功能与关键基因位点去甲基化密切相关，如IFNG启动子去甲基化和TBX21转录增强。KIR基因表达遵循两步表观遗传模型：初始以活性组蛋白标志为特征的许可阶段，随后是基因特异性DNA去甲基化锁定表达潜能。NKG2A等位基因特异性表达由Klrc1启动子处协同DNA低甲基化和组蛋白乙酰化维持。