个体与混合黑籽（BS）、椰子（COCO）、芝麻（SMS）和橄榄油（OVO）纳米乳的体外伤口愈合活性比较研究：基于正常人皮肤成纤维细胞（NHSF）模型

《Scientific Reports》：Comparative in vitro wound-healing activity of individual and blended black seed, coconut, sesame, and olive oil nanoemulsions

　　

本研究旨在使用正常人皮肤成纤维细胞（normal human skin fibroblast, NHSF）细胞系，评价黑籽（black seed, BS）、椰子（coconut, COCO）、芝麻（sesame, SMS）和橄榄油（olive, OVO）及其相应纳米乳（nanoemulsions）的体外（in vitro）伤口愈合疗效，并进行相关性分析。研究人员比较研究了这些油及其纳米乳的再生潜力，同时评价其抗氧化活性（antioxidant activity）。通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT）实验和吖啶橙（acridine orange）染色评估细胞相容性（cytocompatibility），确认所有受试油在所用浓度下均无毒性。采用划痕实验（scratch assay）评价伤口愈合活性。天然油对 COCO + BS 显示出中等伤口闭合率，分别为32.5%和35.1%。相比之下，油纳米乳表现出显著增强的伤口愈合疗效，伤口闭合率分别达到48.3%、51.3%（SMS）、47.8%（COCO）和27.0%（BS），而未处理对照为38.3%。值得注意的是，OVO + SMS 联合配方达到40.6%的伤口闭合率，经纳米乳化后提高至65.3%。同时，COCO + BS 油混合物的纳米乳导致34.7%的伤口闭合率。总体而言，结果表明纳米乳化显著增强天然油的伤口愈合潜力，尤其是橄榄油和芝麻油。观察到的效应可能归因于生物利用度（bioavailability）和抗氧化活性的改善，突出表明基于 COCO 和 OVO 油的纳米乳是有前景的天然候选物，可用于伤口愈合和再生应用。

论文主体解读

慢性伤口发生逐年增长，延迟愈合显著影响患者生活质量，并给患者、家庭和医疗系统带来负担。皮肤虽具自我再生能力，但严重伤口仍需适当治疗。天然产物因具有抗氧化、抗炎、促血管生成和免疫调节特性，在调控伤口愈合机制中具有治疗潜力。慢性伤口愈合延迟常由高水平活性氧导致炎症；抗氧化剂减轻氧化应激可刺激伤口修复。脂肪酸油在皮肤再生过程中起重要作用。橄榄油含酚类等生物活性物质；初榨椰子油富含维生素和抗氧化剂；黑籽油含百里醌（thymoquinone）、酚类、亚油酸和油酸；芝麻油含芝麻素（sesamin）、芝麻林素（sesamolin）和芝麻酚（sesamol）等木脂素。纳米系统，尤其纳米乳（nanoemulsions，亚微米级液滴分散体系），可提高功效、靶向递送、生物利用度和稳定性，促进更深皮肤渗透和控释。然而，天然油应用常受皮肤渗透差、物理化学不稳定和快速氧化限制；混合黑籽、椰子、芝麻和橄榄油用于伤口愈合的潜在益处尚未充分探索。因此，研究人员制备并表征含这四种油单独及混合配方的纳米乳，评价其体外伤口愈合潜力；新颖性在于比较单油与多油纳米乳，以探索可能协同相互作用。

研究人员制备六种油纳米乳：OVO、SMS、COCO、BS 及 OVO+SMS、COCO+BS。油来自 National Research Centre, Egypt 的油提取单元；正常人皮肤成纤维细胞 HFB4 购自 VACSERA, Egypt。关键技术包括：以乳清蛋白浓缩物（whey protein concentrate, WPC）稳定水包油纳米乳，经高速均质和超声制备；用气相色谱-火焰离子化检测器（gas chromatography-flame ionization detector, GC-FID）测定脂肪酸组成；用动态光散射（dynamic light scattering, DLS）测粒径和 zeta 电位，测粘度、pH 和7天稳定性，并用透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）观察形态；用 DPPH、ABTS 和总酚含量（total phenolic content, TPC）评价抗氧化；用 MTT 和吖啶橙染色评价细胞毒性和形态；用划痕实验（scratch assay）评价伤口闭合；统计采用单因素方差分析（analysis of variance, ANOVA），p<0.05为显著。

研究结果如下。脂肪酸组成（Fatty acid composition）：OVO 以油酸 C_18:1 为主，为66.57%，并含棕榈酸 C_16:0 18.11%、亚油酸 C_18:2 11.92%。SMS 含油酸33.53%、亚油酸27.34%、棕榈酸6.65%。OVO+SMS 呈中间谱，油酸50.09%、亚油酸16.29%。BS 以亚油酸56.80%为主，另含油酸23.24%、棕榈酸15.87%。COCO 以月桂酸 C_12:0 42.60%为主，另含肉豆蔻酸 C_14:0 17.48%、棕榈酸10.22%。COCO+BS 显示双重指纹，亚油酸39.56%及中链脂肪酸；该混合可能改善 BS 油稳定性并保留其生物活性。粘度和 pH：OVO 粘度最高，为1.90，其次 SMS 1.25、BS 1.19，COCO 最低0.69；OVO+SMS 为1.09，COCO+BS 为0.63。pH 范围为6.50至6.84，OVO 最低6.50，BS 最高6.84；混合对 pH 影响较小，轻微酸性至近中性有利于外用和皮肤相容性。粒径和 zeta 电位：COCO+BS 粒径最小，为84.63±6.22 nm，其次 BS 95.37±8.04 nm、SMS 147.6±14.62 nm，OVO+SMS 最大，为210.7±27.41 nm。所有 zeta 电位为负，范围?30.4至?37.5 mV；OVO+SMS 最高，为?37.5±0.31 mV，COCO+BS、BS、COCO 为?33.6至?33.0 mV，SMS 和 OVO+SMS 均为?30.4 mV。分离率为0.5至3.0%，OVO 和 SMS 为3.0%，COCO 为1.5%，COCO+BS 和 BS 为1.0%，OVO+SMS 最低0.5%。结果表明稳定性受粒径和 zeta 电位共同影响，更负 zeta 电位可能减少液滴聚集，较小粒径也可能改善抗相分离；COCO+BS 纳米乳具有最小粒径和可接受 zeta 电位，性质最理想。形态学：TEM 显示所有配方均为纳米级、圆形至多边形结构，但分布和聚集程度不同；WPC 在油水界面吸附形成粘弹性界面膜。OVO 中等聚集，SMS 分布较异质，OVO+SMS 密集聚集，COCO 局部聚集，BS 异质且以小结构为主，COCO+BS 高密度小颗粒。该结果与 DLS 定性一致，但 TEM 中的聚集可能部分来自脱水、干燥和样品沉积。抗氧化活性和总酚含量：BS 纳米乳抗氧化最强，约80% DPPH、93% ABTS抑制；COCO+BS 约75% DPPH、92% ABTS；OVO 约72% DPPH、91% ABTS；OVO+SMS 约59% DPPH、73% ABTS；SMS 约55% DPPH、68% ABTS；COCO 最低，约7% DPPH、31% ABTS。TPC 趋势总体类似，BS 最高，COCO+BS 较高，OVO 较高；但抗氧化排名与 TPC 不完全成比例，提示非酚类生物活性化合物也可能贡献。ABTS 值普遍高于 DPPH，反映两种方法对亲水和亲脂化合物的敏感性差异。结论是 BS 和 COCO+BS 为最有前景的抗氧化配方。MTT 细胞毒性：油样本对 HFB4 细胞的 IC₅₀ 从 OVO+SMS 的22.6 μL/mL到 SMS 的19.4 μL/mL；COCO、COCO+BS、BS 的 IC₅₀ 分别为5.7、5.1、2.4 μL/mL。随浓度降低，细胞活力增加；SMS 从25降至1.75 μL/mL时活力由26.8%升至98.1%，OVO 由49.9%升至98.8%，OVO+SMS 在1.75 μL/mL时为99.1%；BS 在1.75 μL/mL时最低，为63.8%。纳米乳安全性提高：COCO+BS 最无毒，IC₅₀=381.3 μL/mL；BS 最低，为55.6 μL/mL；SMS、OVO、COCO 分别为115.8、60.2、78.4 μL/mL，OVO+SMS 为60.2 μL/mL。纳米乳化使 SMS 的 IC₅₀ 从19.4升至115.8 μL/mL，使 COCO+BS 从5.1升至381.3 μL/mL。结论是纳米乳化提高油对 HFB4 细胞的安全性。划痕实验：COCO 和 OVO 原油伤口闭合率分别为32.5%和35.1%，OVO+SMS 混合油为40.6%。纳米乳化后，OVO 从35.1%升至48.3%，COCO 从32.5%升至47.8%，SMS 纳米乳为51.3%，OVO+SMS 从40.6%升至65.3%，BS 纳米乳为27.0%，COCO+BS 纳米乳为34.7%；未处理对照为38.3%。结论是纳米乳化提高伤口闭合能力，尤其橄榄油和芝麻油，OVO+SMS 改善最明显。吖啶橙染色：处理纳米乳后，细胞形态与未处理对照相似，无明显细胞毒形态改变或严重细胞损伤，提示所研究纳米乳在实验条件下具有良好细胞相容性。

讨论部分指出，纳米乳优于油，因减小液滴尺寸、促进扩散、提高酶可及性、快速递送和增强生物活性；其界面面积大，可提高溶解度和生物利用度；负电荷表面增强位点特异性；可刺激成纤维细胞增殖和迁移；低表面张力和热力学稳定有利于更深皮肤穿透。油混合可能提供更广泛生物活性成分，但各油具体贡献和协同作用需进一步研究。当前结果局限于体外模型，划痕实验不能完全复现体内复杂过程，且未研究分子机制；需更多相关细胞模型、机制研究、长期暴露和体内动物模型验证安全性、机制和疗效。研究结论翻译：本研究证明，与相应天然油相比，纳米乳化增强了若干受试天然油配方在正常人皮肤成纤维细胞中的体外伤口闭合活性。在受试配方中，含椰子油和芝麻油的纳米乳，以及混合橄榄+芝麻油纳米乳，表现出有前景的伤口闭合反应，其中橄榄+芝麻油纳米乳改善最明显。这些发现提示，纳米乳化可能改善选定天然油在体外成纤维细胞伤口愈合模型中的功能表现。然而，当前发现仅限于体外细胞模型，不应被解释为临床或治疗有效性的证据。需要进一步研究，包括额外相关细胞模型、机制研究和适当的体内伤口愈合模型，以验证观察到的效果，并确定这些纳米乳在未来伤口护理配方中的安全性、有效性和潜在适用性。