G31P–BPI233双功能融合蛋白调控中性粒细胞驱动炎症并保护免受碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌感染的机制研究

《Emerging Microbes & Infections》：A novel CXCL8(3–72) K11R/G31P–BPI233 hybrid protein modulates neutrophil-driven inflammation and protects against carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii infection

　　

专业摘要翻译 碳青霉烯耐药革兰阴性菌（CRGNB）对全球健康构成严重威胁。碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）是CRGNB中最关键的威胁之一，亟需有效的非抗生素治疗策略。杀菌/通透性增加蛋白（BPI）衍生分子对革兰阴性菌具有抗菌和内毒素中和活性，而CXCL8(3–72) K11R/G31P（G31P）是在K11和G31位点发生突变的CXCL8类似物，能够拮抗ELR-CXC趋化因子介导的中性粒细胞趋化。研究人员设计了一种双功能融合蛋白G31P–BPI233，将BPI介导的抗菌活性与中性粒细胞驱动炎症的调控相结合。重组G31P–BPI233在CHO-K1细胞中表达，并通过安全性评价、内毒素中和、杀菌活性、血清杀菌、中性粒细胞杀菌、趋化、细胞因子、吞噬及NET相关标志物检测进行表征，随后在CRAB败血症和肺炎小鼠模型中验证。短期安全性评估显示24小时内的初步耐受性，而G31P–BPI233降低了残余内毒素活性，并对多种革兰阴性菌表现出浓度依赖性杀菌活性。在摩尔匹配剂量下，其保留了G31P介导的中性粒细胞迁移抑制作用以及BPI233相关的杀菌和细胞因子抑制活性。在CRAB模型中，G31P–BPI233提高了败血症存活率，降低了肺炎相关的细菌负荷和炎症损伤，在终点指标上优于G31P、BPI233或其等摩尔混合物。若干肺炎结局在G31P–BPI233与黏菌素之间无显著差异。使用BPI缺陷小鼠的机制研究进一步证明，内源性BPI在CRAB感染期间有助于细菌清除、内毒素控制和中性粒细胞成熟及效应功能。综上，这些发现表明G31P–BPI233是一种有前景的针对严重CRAB感染的宿主导向抗菌融合蛋白，对更广泛的CRGNB管理具有潜在的转化意义。

论文解读

一、研究背景与问题

由于抗生素的不当使用，抗生素耐药性对全球人类健康构成重大威胁。碳青霉烯耐药革兰阴性菌（CRGNB）对医院获得性感染构成重大全球威胁，尤其在危重症和免疫功能低下患者中。这些病原体常引起医院获得性肺炎、呼吸机相关性肺炎和血流感染。在CRGNB中，碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）因其显著的耐药性获取能力、在医院环境中持续存在的能力以及对宿主和治疗相关胁迫的耐受能力而尤为令人关注。全球引起医院获得性肺炎/呼吸机相关性肺炎的鲍曼不动杆菌分离株中，多重耐药（MDR）的合并流行率为79.9%。碳青霉烯耐药率在亚洲、东欧和拉丁美洲为30%至90%，部分地区超过90%，CRAB引起的医院获得性肺炎和血流感染死亡率高达60%。由于新抗生素的研发速度滞后于耐药性的出现，开发新型非抗生素生物制剂以满足这一未满足的临床需求尤为紧迫。

杀菌/通透性增加蛋白（BPI）是一种主要储存于中性粒细胞颗粒中的阳离子抗菌蛋白，在针对革兰阴性菌的先天免疫中发挥关键作用，具有强大的脂多糖（LPS）结合和杀菌活性。BPI的N端区域结合LPS、中和内毒素活性，并通过损伤细菌外膜发挥直接杀菌作用。然而，以往BPI衍生治疗药物主要聚焦于抗菌和内毒素中和活性，无法直接调控严重革兰阴性菌肺炎中趋化因子驱动的中性粒细胞募集和过度炎症损伤。

中性粒细胞在革兰阴性菌感染的早期防御中通过吞噬、胞内杀伤以及释放抗菌分子和可溶性介质发挥关键作用。然而，炎症反应往往过度并可能损伤正常组织。趋化因子CXCL8/IL-8可结合G蛋白偶联受体，CXCL8依赖性中性粒细胞募集虽对抗菌防御重要，但失控的CXCL8信号与急性及慢性炎症疾病（包括炎症性肺损伤）有关。G31P是CXCL8在K11和G31位点突变的类似物，是CXCR1和CXCR2的高亲和力拮抗剂，可抑制中性粒细胞趋化并减轻中性粒细胞主导的肺部炎症，但G31P仅作为免疫调节剂，缺乏直接抗菌活性，无法解决病原体负荷问题。

基于上述背景，研究人员设计了将CXCL8(3–72) K11R/G31P通过柔性连接子与BPI₂₃₃融合的新型杂合蛋白G31P–BPI₂₃₃，旨在同时增强抗菌防御并限制过度中性粒细胞相关炎症。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员构建了G31P–BPI₂₃₃融合蛋白表达载体，在CHO-K1细胞中通过电穿孔转染和甲硫氨酸亚砜胺（MSX）筛选获得稳定高表达克隆，采用阳离子交换层析纯化，并通过Western blot验证蛋白身份。利用AlphaFold2/ColabFold进行结构预测。研究采用鲎变形细胞溶解物（LAL）显色法检测内毒素中和活性，通过Transwell迁移实验评估中性粒细胞趋化抑制，采用剂量–反应杀菌实验、血清杀菌实验和中性粒细胞杀菌实验评估抗菌活性，通过ELISA检测细胞因子水平，利用流式细胞术分析中性粒细胞表型、成熟状态、吞噬功能和凋亡，并检测髓过氧化物酶（MPO）和细胞外双链DNA（dsDNA）作为NET相关标志物。动物实验采用BALB/c小鼠及BPI基因敲除（BPI^?/?）小鼠，构建CRAB败血症和肺炎模型。临床CRAB分离株（99389、99391、99392、99393、99394）来源于中日友好医院肺炎患者的呼吸道标本，经MALDI–TOF MS鉴定和VITEK 2系统进行药敏检测。人外周血来自健康志愿者，经中日友好医院伦理委员会批准。

三、研究结果

G31P–BPI₂₃₃融合蛋白的生成与表征。 序列分析确认了设计的蛋白结构和引入的突变。AlphaFold2/ColabFold建模显示由柔性连接子连接的双结构域结构。融合蛋白在CHO-K1细胞中成功表达并经阳离子交换层析纯化，Western blot显示预期分子量处的主条带。在90%非热灭活小鼠血清中37°C孵育2、8和24小时后，全长大小的蛋白条带仍可检测到。LAL检测显示G31P–BPI₂₃₃以剂量依赖方式降低残余内毒素活性。药代动力学研究显示静脉注射后循环免疫反应性快速下降，表观半衰期约1.3小时。安全性评估中，治疗剂量给药后24小时内未检测到明显的急性全身毒性或肝、肾损伤。

G31P–BPI₂₃₃对参考菌株和临床CRAB分离株表现出剂量依赖性杀菌活性。 针对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌等参考菌株及5株临床CRAB分离株的剂量–反应实验显示，G31P–BPI₂₃₃对所有测试菌株均产生浓度依赖性杀伤。在125–250 μg/mL时对大多数参考菌株实现接近完全杀伤，而肺炎克雷伯菌ATCC 700603在所测浓度范围内敏感性较低。5株临床分离株均对亚胺培南和美罗培南耐药，但对G31P–BPI₂₃₃呈浓度依赖性敏感，在31.25–62.5 μg/mL时观察到接近完全杀伤。在摩尔匹配剂量下，G31P–BPI₂₃₃、BPI₂₃₃单独及非共价G31P+BPI₂₃₃混合物之间的杀菌活性无显著差异，而G31P单独几乎无直接杀菌活性，表明融合后保留了BPI₂₃₃相关的杀菌功能。

G31P–BPI₂₃₃抑制CXCL8诱导的中性粒细胞趋化。 Transwell实验显示，G31P–BPI₂₃₃在20和200 ng/mL浓度下显著降低趋化指数。在摩尔匹配剂量下，G31P单独和G31P+BPI₂₃₃混合物也抑制中性粒细胞迁移，而BPI₂₃₃单独几乎没有抑制活性，表明融合蛋白保留了G31P组分的CXCL8拮抗活性。

G31P–BPI₂₃₃与血清和中性粒细胞介导的杀菌活性协同。 人血清单独和人中性粒细胞单独分别显示约23%和27%的温和杀菌率。G31P–BPI₂₃₃单独以剂量依赖方式杀灭CRAB，加入人血清或人中性粒细胞后杀菌率进一步增加。在摩尔匹配剂量下，G31P单独几乎无直接杀菌活性，而BPI₂₃₃、G31P+BPI₂₃₃混合物和G31P–BPI₂₃₃在有或无血清或中性粒细胞条件下均产生相当的杀伤效果。

G31P–BPI₂₃₃在人PBMC中的抗炎活性。 LPS刺激的人外周血单个核细胞（PBMC）经不同处理后，G31P单独对LPS诱导的细胞因子产生几乎没有影响，而BPI₂₃₃、G31P+BPI₂₃₃混合物和G31P–BPI₂₃₃均降低IL-6和TNF-α的分泌，三者效果无显著差异。

G31P–BPI₂₃₃在体内保护小鼠免受CRAB败血症和肺部感染。 在CRAB败血症模型中，盐水处理小鼠在感染后1天内迅速死亡，而G31P–BPI₂₃₃处理小鼠在3天时保持100%存活。在CRAB肺炎模型中，G31P–BPI₂₃₃显著降低组织学肺损伤评分，与盐水相比显著降低肺组织IL-6和TNF-α水平，且对这两种炎症介质的降低程度大于BPI₂₃₃单独或混合物。G31P–BPI₂₃₃还显著降低肺细菌负荷和肺内毒素水平。在多数终点指标上，G31P–BPI₂₃₃与黏菌素之间无显著差异。

G31P–BPI₂₃₃减少CRAB肺部感染期间的中性粒细胞募集和NET相关标志物。 流式细胞术显示，与盐水相比，G31P–BPI₂₃₃显著降低肺和外周血中性粒细胞百分比。G31P–BPI₂₃₃还显著降低肺MPO和细胞外dsDNA水平，表明其限制了过度中性粒细胞活化和NET相关炎症反应。

G31P–BPI₂₃₃增强受刺激人中性粒细胞的颗粒摄取、增加凋亡样染色并减少NET相关标志物。 体外实验中，G31P–BPI₂₃₃在细菌刺激组显著增强中性粒细胞珠粒摄取，在LPS或细菌刺激后显著增加Annexin V/PI阳性中性粒细胞百分比，同时显著降低PMA和细菌刺激诱导的MPO和dsDNA释放。

BPI缺陷增加细菌负荷和内毒素血症但不改变中性粒细胞募集。 BPI^?/?小鼠在感染后1和2天肺和脾细菌负荷显著高于野生型（WT）小鼠，血浆内毒素水平也显著升高，但肺和外周血中性粒细胞百分比在两组间相当。

BPI缺陷破坏中性粒细胞成熟但体内不显著影响中性粒细胞凋亡。 Annexin V/PI染色显示感染后2天WT和BPI^?/?小鼠肺内早期或晚期凋亡中性粒细胞无显著差异。骨髓分析显示BPI^?/?小鼠前中性粒细胞和未成熟中性粒细胞比例更高，成熟中性粒细胞比例更低。

BPI缺陷损害中性粒细胞颗粒摄取功能并失调中性粒细胞活化。 体外实验中，BPI^?/?中性粒细胞在刺激后吞噬能力显著降低，刺激后（尤其细菌刺激）早期和晚期凋亡细胞比例高于WT中性粒细胞，PMA或细菌刺激后dsDNA和MPO水平更高，表明NET相关标志物释放和中性粒细胞活化增加。

四、讨论与结论

讨论部分指出，G31P–BPI₂₃₃保留了两种组分的核心功能，包括BPI₂₃₃相关的内毒素中和和广谱革兰阴性菌杀菌活性，以及G31P相关的CXCL8诱导人中性粒细胞迁移抑制。组分等效比较主要证明了功能保留而非融合后效价统一增强。在CRAB肺炎模型中，G31P–BPI₂₃₃在细菌负荷和内毒素相关结局方面呈有利数值模式，在部分炎症终点指标上具有统计学显著优势，提示共价融合的体内终点特异性优势。中性粒细胞调控可能是保护效应的重要部分，融合蛋白通过促进吞噬功能而非中性粒细胞涌入和脱颗粒来适度限制中性粒细胞相关炎症。BPI^?/?小鼠实验表明内源性BPI在控制革兰阴性菌感染和预防内毒素血症中发挥重要作用，且BPI参与维持细菌感染期间正常的中性粒细胞成熟。

研究存在若干局限性：血清半衰期相对较短（1.3小时），可能需要频繁全身给药；仅评估了一种结构域方向和连接子设计；小鼠缺乏直接的CXCL8/IL-8直系同源物，体内效应不能直接证明CXCL8–CXCR1/CXCR2阻断。

研究结论：G31P–BPI₂₃₃是一种双功能抗感染融合蛋白，保留了BPI₂₃₃相关的革兰阴性菌杀伤和内毒素中和活性，同时保留了G31P相关的CXCL8驱动中性粒细胞趋化抑制作用。该融合蛋白将互补活性整合于单一分子中，在体内提供协调的抗菌和炎症调节效应。通过同时降低病原体负荷和限制中性粒细胞相关炎症损伤，G31P–BPI₂₃₃代表了针对严重CRAB肺炎的一种有前景的宿主导向抗菌策略。