REV-ERBα拮抗剂SR8278改善帕金森病小鼠模型运动功能障碍的机制研究

《Animal Cells and Systems》：Pharmacological inhibition of REV-ERBα ameliorates motor deficits in the 6-OHDA-lesioned mouse model of Parkinson’s disease

　　

帕金森病（Parkinson's disease, PD）以黑质纹状体多巴胺能（dopaminergic, DAergic）神经元变性及运动功能障碍为特征。许多PD患者同时表现出昼夜节律紊乱，越来越多的证据将生物钟功能失调与PD病理联系起来。REV-ERBα是一种昼夜节律核受体，在生理条件下调控多巴胺能基因表达。然而，其在PD中黑质纹状体多巴胺（dopamine, DA）稳态及运动功能中的作用尚不清楚。本研究发现，在6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine, 6-OHDA）诱导的PD小鼠模型中，黑质（substantia nigra, SN）酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）阳性神经元内Rev-erbα mRNA表达升高。为验证其功能作用，研究人员评估了SN局部微量注射REV-ERBα拮抗剂SR8278的急性效应。结果发现，SR8278部分恢复了运动表现并改善了精细运动功能，且该效应不受昼夜节律时间影响。SR8278给药并未恢复纹状体和SN中TH表达或组织DA水平。然而，活体微透析显示纹状体细胞外DA转换率增强，具体表现为细胞外DA代谢物水平升高，而基础细胞外DA水平无变化。综上，这些发现将REV-ERBα确定为调节黑质纹状体细胞外DA动态并改善PD运动功能的潜在治疗靶点。

一、研究背景与科学问题

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是最常见的神经退行性疾病之一，以黑质（substantia nigra, SN）多巴胺能（dopaminergic, DAergic）神经元选择性丢失和纹状体多巴胺（dopamine, DA）耗竭为主要病理特征。临床上PD表现为运动迟缓、肌强直和震颤等运动症状，同时伴随睡眠和情绪障碍等非运动症状，后者与昼夜节律失调密切相关。昼夜节律通过由时钟基因组成的转录-翻译反馈环路协调机体每日生理和行为过程。REV-ERBα（NR1D1）是哺乳动物分子钟的核心组分，作为转录抑制因子参与代谢、线粒体功能和神经炎症等多种生理病理过程的调控。已有研究表明，REV-ERBα在脑内DA合成和信号调控中发挥重要作用：Rev-erbα敲除小鼠海马区DA能基因表达和DA转换率升高；在腹侧被盖区（ventral tegmental area, VTA），REV-ERBα通过与DA能神经元功能所必需的核心受体Nurr1的拮抗性相互作用，调控酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）的昼夜节律性表达。在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的DA能神经退行模型中，REV-ERBα激动剂的慢性处理通过作用于小胶质细胞产生抗炎和神经保护效应，而REV-ERBα的药理学抑制则减少MPTP诱导的DA能神经元铁死亡并保护神经元损伤。研究人员前期工作发现，在6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine, 6-OHDA）损伤的PD模型中，SN微量注射REV-ERBα拮抗剂SR8278可在特定时间点恢复昼夜节律依赖的情绪相关行为，并伴随VTA中REV-ERBα-NURR1拮抗调控的恢复和TH节律性表达的恢复。然而，REV-ERBα在帕金森病状态下如何参与黑质纹状体DA稳态的调控仍不清楚。因此，本研究旨在探讨急性药理学调控REV-ERBα对6-OHDA小鼠PD模型中黑质纹状体DA稳态的影响，并评估这些变化与运动行为的关系。

二、研究内容与主要结论

研究人员利用单侧纹状体6-OHDA损伤的PD小鼠模型，通过荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）技术发现，损伤后SN致密部（substantia nigra pars compacta, SNpc）TH阳性神经元中Rev-erbα mRNA表达显著升高且失去昼夜节律，而Nurr1 mRNA则在损伤后出现节律性表达，表明6-OHDA损伤扰乱了DA能神经元中REV-ERBα与Nurr1的正常昼夜关系。为验证REV-ERBα的功能作用，研究人员在行为测试前3小时向SN局部微量注射REV-ERBα拮抗剂SR8278。行为学结果显示，SR8278在主观黎明（CT22-01）和主观黄昏（CT10-13）两个时间点均显著恢复了6-OHDA损伤小鼠在圆柱体测试中对侧前肢使用的不对称性，但对照旋转杆测试中的运动协调表现无影响。在MPTP急性模型中，SR8278同样缩短了爬杆测试的下降潜伏期，改善了运动表现。这些结果表明REV-ERBα抑制可改善精细运动功能，但不影响整体运动协调，且该效应不依赖于昼夜节律时间。在分子水平上，蛋白质印迹和实时定量PCR分析显示，SR8278并未恢复损伤侧SN中TH蛋白水平以及囊泡单胺转运体2（VMAT2）、多巴胺转运体（DAT）和多巴胺D2受体（DRD2）的mRNA表达。高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ECD）结果显示，SR8278未改变纹状体和SN中的组织DA含量、DA代谢物水平或组织DA转换率。然而，活体微透析结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析发现，SR8278虽未改变细胞外DA水平，但显著升高了6-OHDA损伤小鼠纹状体细胞外DOPAC和HVA水平，使细胞外DA转换率恢复至接近对照水平。

三、主要技术方法

本研究采用的技术方法主要包括：单侧纹状体6-OHDA注射建立PD小鼠模型和MPTP急性PD模型；SN立体定位微量注射SR8278进行药理学干预；圆柱体测试、旋转杆测试和爬杆测试评估运动功能；荧光原位杂交（FISH）检测SNpc中Rev-erbα、Nurr1和TH的mRNA表达；蛋白质印迹检测TH蛋白水平；实时定量PCR检测VMAT2、DAT和DRD2的mRNA表达；高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ECD）测定纹状体和SN组织中的DA及其代谢物含量；活体微透析结合LC-MS/MS检测纹状体细胞外DA及其代谢物的动态变化。实验动物为雄性C57BL/6J野生型小鼠。

四、研究结果

1. 1.
   6-OHDA损伤后SNpc DA能神经元中Rev-erbα mRNA的节律性表达被破坏

通过FISH分析发现，6-OHDA损伤后SNpc中TH阳性神经元数量显著减少，而VTA相对保留。在假手术小鼠中，SNpc TH阳性神经元中Rev-erbα mRNA呈现明显的昼夜节律，在CT12达到峰值；6-OHDA损伤后该节律消失，且CT00时表达仍维持在高水平。相反，Nurr1 mRNA在假手术小鼠中无节律性，但在6-OHDA损伤后出现节律性表达。

1. 2.
   SR8278给药挽救6-OHDA损伤小鼠的精细运动行为但不影响运动协调

在圆柱体测试中，6-OHDA损伤小鼠对侧前肢使用率显著降低，SR8278在CT22-01和CT10-13两个时间点均显著恢复了对侧前肢使用。在旋转杆测试中，假手术与6-OHDA损伤小鼠的掉落潜伏期无差异，SR8278亦无影响。在MPTP模型中，SR8278缩短了爬杆下降时间，改善了运动表现。

1. 3.
   急性SR8278注射不恢复SN中TH及其他DA能标志物

蛋白质印迹显示6-OHDA损伤后同侧SN中TH蛋白水平降低，SR8278未恢复TH表达。定量PCR显示VMAT2、DAT和DRD2的mRNA表达在损伤后均降低，SR8278未改变其表达水平。

1. 4.
   急性SR8278处理不改变纹状体和SN中的DA含量及DA转换率

HPLC-ECD分析显示，6-OHDA损伤小鼠纹状体DA含量显著降低，SN中DA含量呈较小幅度的下降趋势。SR8278未改变两个区域的DA水平。纹状体中DOPAC和HVA水平在各组间无差异；SN中HVA水平在损伤后降低，SR8278无影响。纹状体DA转换率在损伤后轻度升高，SR8278未改变组织DA转换率。

1. 5.
   SR8278微量注射增加细胞外DA转换率而不改变细胞外DA水平

活体微透析结果显示，各组间基础细胞外DA水平无差异。6-OHDA损伤小鼠纹状体细胞外DOPAC和HVA水平显著降低，SR8278处理后两者均升高并恢复至接近对照水平。细胞外DA转换率在损伤后降低，SR8278处理后升高。

五、讨论与结论

本研究表明，SN局部微量注射REV-ERBα拮抗剂SR8278可改善6-OHDA损伤PD小鼠模型的精细运动功能，该效应伴随纹状体细胞外DA代谢物（DOPAC和HVA）升高，即细胞外DA转换率增加，而基础细胞外DA水平不变。SR8278未恢复DA合成相关标志物或组织DA含量。圆柱体测试对单侧DA能损伤后的精细运动缺陷敏感，爬杆测试反映与黑质纹状体DA能功能障碍相关的运动迟缓，而旋转杆测试依赖全身平衡和协调，不一定仅由黑质纹状体DA能功能决定，这解释了SR8278对不同行为学测试的选择性效应。在6-OHDA模型中，纹状体组织DA含量降低而基础细胞外DA水平维持不变，这与既往研究一致，表明尽管组织DA大量丢失，基础细胞外DA仍可维持，但细胞外DA转换率降低。SR8278通过增加细胞外DA转换率而非恢复DA合成来改善运动功能，提示REV-ERBα拮抗可能通过影响DA释放、再摄取和细胞外降解等多重机制重新平衡DA的可用性和清除。由于细胞外DA代谢涉及神经元和非神经元细胞中COMT和MAO依赖的途径，REV-ERBα拮抗可能通过多种细胞机制影响DA调控。与VTA中SR8278可增加TH转录不同，SN中未观察到类似效应，可能原因是损伤侧SN中大量神经元丢失限制了REV-ERBα依赖的转录反应。综上，REV-ERBα拮抗剂SR8278通过增加细胞外DA转换率改善PD小鼠模型的精细运动功能。结合研究人员此前关于情绪相关行为的发现，REV-ERBα调控有望成为同时改善PD运动症状和昼夜节律相关非运动症状的潜在治疗靶点。