靶向Phox2b+初级内脏感觉神经元的AAV递送策略系统评估

《Animal Cells and Systems》：Systematic evaluation of AAV administration strategies for targeting Phox2b?+?primary visceral sensory neurons

　　

内脏感觉神经元（VSNs）在内感受中发挥关键作用，但由于其解剖位置以及与中枢自主神经环路共享分子标记，使用遗传工具选择性获取这些神经元仍然具有挑战性。尽管已有可视化Phox2b表达神经元的转基因模型用于遗传标记VSNs，但后脑中同时存在的Phox2b表达限制了其选择性。为克服这些限制，研究人员构建了多个Phox2b启动子驱动的腺相关病毒（AAV）载体，并评估了衣壳血清型、递送途径和注射时间的影响。通过系统递送AAV-PHP.S-Phox2b-Cre，研究人员发现出生后第8天（P8）是以相对较低剂量高效、选择性标记VSNs的最佳时间窗。这一结果与新生期给药形成对比：相同剂量在新生期导致广泛的异位标记。出乎意料的是，舌黏膜下递送AAV-retro-Phox2b-Cre（最初旨在标记舌支配感觉神经元）也标记了大多数迷走神经元。这些标记神经元具有AAV-retro衣壳特异性，因为局部递送AAV-PHP.S-Phox2b-Cre仅标记注射部位附近的细胞。总之，该研究为使用AAV选择性遗传获取VSNs提供了实用参数。

内脏感觉神经元（VSNs）是传递内脏器官生理状态至中枢系统的内感受神经元，对呼吸、心血管稳态及摄食等自主过程至关重要。VSNs胞体位于深在的颅感觉神经节，外周末梢分布于多器官，因此难以用遗传工具选择性标记。VSNs表达Phox2b同源盒转录因子，但Phox2b-Cre/FLPo转基因小鼠也会标记脑干孤束核（NTS）、最后区（AP）、面后核、疑核等中枢Phox2b+群体。重组腺相关病毒（AAV）载体为遗传靶向提供了灵活手段，但VSNs胞体所在神经节位置深在，直接注射有创且技术要求高；AAV包装容量又限制了使用大段调控元件实现高选择性表达。因此，单靠启动子选择不足以实现VSNs选择性靶向，需要综合考虑衣壳趋向性、递送途径、发育阶段和病毒剂量。

研究人员构建了由Phox2b启动子驱动的AAV载体，以Rosa26-lsl-Salsa6f报告小鼠为模型，系统比较了AAV-PHP.S与AAV-retro衣壳、成年/出生后第0天（P0）/出生后第8天（P8）时间点、系统（眶后或皮下）与舌黏膜下局部递送，以及不同病毒剂量对标记效率与解剖特异性的影响。研究发现，P8系统递送能够在相对低剂量下高效且选择性标记VSNs；舌黏膜下AAV-retro递送则意外广泛标记迷走感觉通路，且该现象具有衣壳特异性。该研究为AAV靶向VSNs提供了实用参数，也为难以直接注射的深部外周神经元群体提供了微创遗传操作方案。

关键技术方法包括：1）分子克隆与病毒包装：从小鼠基因组扩增1,925 bp的Phox2b启动子片段，替换AAV骨架中的Ef1a启动子，构建pAAV-Phox2b-Cre；利用AAV293T细胞三质粒共转染分别包装AAV-PHP.S和AAV-retro衣壳。2）动物模型与递送：使用Rosa26-lsl-Salsa6f报告小鼠（The Jackson Laboratory），通过成年小鼠眶后静脉窦注射、P0/P8小鼠皮下注射及成年小鼠舌黏膜下注射给予不同剂量病毒。3）组织学评估：免疫组织化学结合共聚焦成像检测tdTomato报告表达。4）功能验证：采用微流控舌刺激系统与双光子钙成像记录Phox2b+味觉末梢对甜味剂安赛蜜（AceK）的GCaMP6f钙信号。

研究结果如下：

结果1：重组AAV的构建与成年系统递送。研究人员克隆1925 bp Phox2b启动子并包装为AAV-PHP.S-Phox2b-Cre，经眶后注射高剂量（>10¹² vg）至成年报告小鼠，2周后观察到舌菌状乳头（FuP）和轮廓乳头（CVP）味蕾、小肠、结状-岩神经节（NPG）及脑干NTS的tdTomato标记，而三叉神经脊髓束等体感区域标记极少，证明该启动子足以在AAV递送后驱动VSNs选择性表达。

结果2：成年系统AAV-PHP.S转导效率呈剂量依赖性。以低10倍剂量（2.2 × 10¹¹ vg）注射成年小鼠，外周靶器官和NTS均无标记，仅AP有稀疏信号，说明成年小鼠高效系统标记需要高于10¹² vg的剂量。

结果3：P0系统递送提高效率但损害特异性。给P0小鼠皮下注射1.68 × 10¹¹ vg，8周后观察发现外周VSNs和NPG标记更广，但脑干三叉神经脊髓束、脉络丛、前脑皮层等出现异位标记，说明P0递送效率提高以特异性下降为代价。

结果4：P8系统递送兼顾效率与特异性。给P8小鼠皮下注射4.28 × 10¹¹ vg，保留了外周强标记，同时三叉神经脊髓束和前脑异位标记明显减少，表明P8是相对低剂量下高效且选择性标记VSNs的合适时间窗。

结果5：舌黏膜下AAV-retro递送广泛标记VSNs。成年小鼠舌黏膜下注射AAV-retro-Phox2b-Cre，除舌味蕾神经外，NPG多数神经元和肠道迷走传入也被标记，但三叉神经节（TG）和体感脑干区域无标记，说明该递送可在维持Phox2b选择性的同时跨越注射部位广泛转导VSNs。

结果6：AAV-retro的广泛标记具有衣壳特异性。相同途径注射AAV-PHP.S-Phox2b-Cre，仅注射部位附近及舌下核等局部标记，未出现远端内脏标记，证明广泛重新分布依赖AAV-retro衣壳。

结果7：Phox2b+味觉神经元的功能验证。三种策略（成年高剂量系统PHP.S、P0系统PHP.S、成年舌内AAV-retro）均使Phox2b+神经元表达GCaMP6f；双光子钙成像显示40 mM AceK均可靠诱发与刺激同步的钙瞬变，说明三种策略均支持味觉传入的功能成像。

讨论部分指出，仅凭启动子选择性不足以预测靶向结果；P0的高效率可能源于血脑屏障未成熟或Phox2b启动子活性发育变化；P8递送在保持效率的同时明显减少异位标记。舌黏膜下AAV-retro的广泛标记难以用局部扩散解释，且具有一定选择性（未标记TG和体感区），提示AAV-retro可通过舌部靶区进入或接近内脏感觉通路，但机制尚不清楚；AAV-PHP.S局部递送无此现象，说明该效应为AAV-retro所特有。该策略虽未实现器官限制性标记，但避免了神经节直接注射并保持Phox2b+ VSNs选择性；进一步降低剂量可能改善器官特异性。类似策略还可推广至其他以外周神经节或神经丛为靶点的启动子。研究结论可翻译为：选择性病毒获取VSNs取决于启动子特异性、衣壳血清型、递送途径、发育时间点和病毒剂量，设计针对Phox2b+ VSNs及其他深部外周神经元群体的病毒策略时均应考虑这些参数。