高静水压辅助酶解制备膨腹海马抗氧化肽及其对小鼠雄性生殖功能障碍保护作用的研究

《Antioxidants》：Preparation of Antioxidant Peptides from Hippocampus Abdominalis via High Hydrostatic Pressure-Assisted Enzymolysis: Evaluation of Their Protective Effects Against Male Reproductive Dysfunction in Mice

　　

膨腹海马(Hippocampus abdominalis)是一种具有多种功能活性的重要海洋硬骨鱼类。因此，本研究旨在分离和制备来源于膨腹海马的创新性抗氧化肽，并评估其蛋白水解物(HAPH)对雷公藤甲素(TP)所致雄性小鼠生殖损伤的保护和恢复作用。值得注意的是，在七种被筛选的蛋白酶中，胃蛋白酶最终被确定为首选蛋白酶。高静水压(HHP)预处理显著提高了胃蛋白酶水解物的肽产量和抗氧化活性。随后，通过单因素实验和响应面法确定了最佳酶解条件：酶/底物比(E/S)为3%(w/w)，水解时间为3 h，固/液比(S/L)为1:25(w/v)，HHP压力为200 MPa，HHP处理时间为9 min。分子量低于3 kDa的肽组分(HAPH-1)表现出更强的抗氧化活性以及对pH、温度和模拟胃肠道消化优异的稳定性。此外，动物实验表明，HAPH-1减轻了雷公藤甲素诱导的小鼠精子发生受损和睾丸组织损伤，其潜在机制涉及调控Keap1-Nrf2通路和Bcl-2/Bax/caspase-3凋亡信号通路。最后，通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析、分子对接和体外活性验证，成功筛选出三种具有高抗氧化活性的新型肽(GPAPWGF、FPALLF和LPLPLF)。综上所述，本研究为膨腹海马的高值化利用和新型抗氧化功能组分的开发提供了新的见解。

**论文解读：高静水压辅助酶解制备膨腹海马抗氧化肽及其保护雄性生殖功能障碍的作用机制**

不孕症被定义为规律无保护性行为12个月以上未能实现临床妊娠，已成为严峻的全球性健康问题。全球约8%-12%的育龄夫妇受不孕症困扰，其中男性因素约占30%-50%。男性生殖功能障碍，如无精子症和睾丸功能障碍，是男性不育的主要病因。现代生活方式改变（如接触农药、重金属、工业化学品，以及肥胖、吸烟、酗酒、营养不良和久坐等）加剧了男性生殖功能障碍的患病率。目前辅助生殖技术（ART）和药物治疗是主要干预手段，但ART可能增加后代远期代谢疾病风险，药物如西地那非则可能诱发眼部疾病。因此，寻找兼具改善生殖潜力和优异安全性的天然产物成为研究热点。生物活性肽（BPs）因高生物利用度、强生物活性和高稳定性而备受关注，其中抗氧化肽可清除自由基并增强内源抗氧化酶活性，在改善雄性生殖功能方面潜力巨大。海马是传统药材，膨腹海马（Hippocampus abdominalis）因生长快、适应性强成为全球重要养殖物种，其干重约含70%蛋白质，富含疏水氨基酸，是制备抗氧化肽的理想来源。然而，目前尚无研究系统地制备膨腹海马抗氧化肽并评估其对雄性生殖功能障碍的改善效果。高静水压（HHP）辅助酶解可通过展开蛋白质结构、增加酶切位点暴露来提高酶解效率，但该技术在膨腹海马肽制备中的应用尚属空白。因此，本研究旨在通过HHP辅助酶解从膨腹海马中制备新型抗氧化肽，并探讨其对雄性小鼠生殖功能障碍的改善作用及潜在机制。

研究人员首先对七种蛋白酶进行筛选，确定胃蛋白酶为最优蛋白酶；随后通过单因素实验和Plackett-Burman结合响应面法优化酶解条件，最优参数为E/S 3%（w/w）、水解时间3 h、S/L 1:25（w/v）、HHP压力200 MPa、HHP时间9 min。在此条件下，肽产量达82.69%，DPPH自由基清除活性为60.97%。经3 kDa超滤膜分离获得分子量<3 kDa的组分HAPH-1，其抗氧化活性最强，并表现出优异的pH（3-11）、温度（20-60 °C）和模拟胃肠道消化稳定性。动物实验采用SPF级雄性ICR小鼠（6-8周龄，购自北京SPF生物技术有限公司），通过腹腔注射雷公藤甲素（TP）建立雄性生殖损伤模型，随机分为正常对照组（NC）、模型组（M）、HAPH-1给药组（400 mg/kg/d）和17α-甲基睾酮阳性对照组（MT，10 mg/kg/d）。结果显示，HAPH-1显著恢复TP导致的小鼠睾丸指数下降、睾丸组织形态异常和Johnsen评分降低，提高精子活力、精子数量，降低精子畸形率，并恢复血清睾酮（T）、黄体生成素（LH）和促卵泡激素（FSH）水平。HAPH-1还降低了睾丸组织中丙二醛（MDA）水平和炎症因子白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量，提升了超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和总抗氧化能力（T-AOC）。免疫组化表明HAPH-1上调核因子E2相关因子2（Nrf2）表达、下调Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）表达；TUNEL染色显示其抑制睾丸细胞凋亡，机制涉及上调Bcl-2、下调Bax和caspase-3表达。进一步通过LC-MS/MS鉴定出4033条肽段，结合PeptideRanker、ToxinPred等生物信息学筛选和分子对接，最终锁定GPAPWGF、FPALLF和LPLPLF三个与Keap1结合能最低的新型抗氧化肽，化学合成后验证其DPPH、ABTS和羟自由基清除能力及还原力均显著优于HAPH-1。

本研究的讨论部分指出，胃蛋白酶因其对疏水氨基酸肽键的高效水解能力而优于其他蛋白酶；HHP预处理使蛋白质解折叠、暴露内部极性和疏水性基团，从而提升水解效率。HAPH-1的优越稳定性可归因于低分子量肽形成的次级结构。TP通过损伤下丘脑-垂体-睾丸（HPT）轴、加剧氧化应激和促进凋亡导致生殖损伤，HAPH-1则通过调节HPT轴、激活Keap1-Nrf2通路和抑制Bcl-2/Bax/caspase-3凋亡信号通路发挥保护作用。三个新肽与Keap1关键残基（如Arg380、Arg415、Ser363等）形成氢键和疏水相互作用，赋予其强抗氧化能力。研究结论为：HHP辅助酶解显著提高膨腹海马水解物的肽产量和抗氧化活性；HAPH-1具有优异抗氧化活性和稳定性，能有效缓解TP诱导的小鼠睾丸损伤、氧化应激和炎症，其保护作用与调控Keap1-Nrf2信号通路和Bax/Bcl-2/Caspase-3凋亡通路密切相关；本研究成功鉴定出三种新型抗氧化肽（GPAPWGF、FPALLF、LPLPLF），为膨腹海马的高值化利用和抗氧化功能食品开发奠定了坚实的理论基础。