《Biosensors》：Single-Cell Whole-Transcriptome Detection Expands the Observable RNA Space for AI Virtual-Cell Models
单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）已为细胞图谱和人工智能（artificial intelligence, AI）驱动的虚拟细胞模型提供了可扩展的、基因级别的细胞状态描述。然而，普遍的基于poly(A)的计数检测仅捕获了RNA图景的一部分。在这里，“单细胞全转录组检测（single-cell whole-transcriptome detection）”指基于测序的努力，旨在检测比常规基于poly(A)的基因计数更广泛的RNA生物型；没有任何检测能够无偏地检测或定量所有细胞RNA种类。研究人员比较了RNA捕获范围、转录本结构分辨、时间标记、空间背景和额外模态，将它们作为不同的测量维度。从生物传感的角度来看，分析灵敏度、转录本覆盖度、通量和检测偏差决定了哪些信号可供计算模型使用。研究人员随后检查了细胞状态表征、调控网络、动力学、扰动预测和基础模型。总RNA检测揭示了额外的非编码RNA，长读长方法提供转录本结构信息，时间检测约束RNA动力学。这些信号是否能超越常规基因计数输入改善预测，需要匹配的、任务特定的模型比较。研究人员区分了分子可观测性、统计关联、预测性能和因果验证，其中因果验证需要适当的干预。研究人员提出了控制测序深度、成本、模型架构和保留样本的基准，同时测试特征消融、分布外性能、不确定性校准和实验结果。总之，高通量基于poly(A)的谱分析和更广泛的RNA测量提供了互补的细胞广度和调控深度。
1. Introduction
单细胞RNA测序(scRNA-seq)已为细胞图谱和AI虚拟细胞模型提供可扩展的基因级细胞状态描述，但普遍基于poly(A)的计数分析仅捕获部分RNA景观。本文定义了“单细胞全转录组检测”这一概念，并强调没有任何单一检测能无偏恢复所有RNA。研究进一步区分了分子可观测性、统计关联、预测性能与因果验证等不同证据层次，为后续分析奠定框架。
2. Evolution of Single-Cell Transcriptomic Measurement Technologies: From Poly(A) RNA to a Broader Observable RNA State Space
单细胞转录组检测可视为测序介导的生物传感流程，其性能取决于RNA生物型检出限、捕获效率、文库复杂度、非核糖体RNA读数比例、基因体覆盖、定量精度、细胞回收率、通量和成本等。技术沿多个独立轴分化：捕获化学决定RNA类型，读长结构决定剪接和异构体测量，代谢标记提供时间信息，空间分析保留组织坐标，多组学增加非RNA测量维度。
2.1. Low-Throughput Poly(A)-Based RNA Sequencing
低通量poly(A)测序包括Smart-seq系列等方法，通过oligo-dT引物捕获poly(A)RNA并利用模板转换合成全长cDNA。其优点是每细胞信息含量高、基因体覆盖均匀，可检测低丰度基因、剪接和等位基因表达；缺点是通量低、成本高，且“全长”仅指poly(A)转录本的广泛覆盖，不包含非poly(A)RNA。
2.2. High-Throughput Poly(A)-Based RNA Sequencing
高通量poly(A)测序采用微滴或组合索引分配细胞条形码和UMI，代表方法包括Drop-seq、inDrop、Seq-Well、10x Genomics、sci-RNA-seq和SPLiT-seq。这类方法可处理数千至数十万细胞，支持稀有群体发现和大型扰动筛选，但多数读数来自转录本3'或5'端，通常输出基因水平计数矩阵，缺乏完整异构体、非poly(A)RNA和短调节RNA信息。
2.3. Single-Cell Total-RNA Capture
单细胞总RNA捕获旨在降低oligo-dT限制，使非poly(A)RNA、RNA前体、剪接中间体和短RNA可被检测。方法包括SUPeR-seq、MATQ-seq、RamDA-seq、scDASH、Smart-seq-total、VASA-seq、STORM-seq和TotalX等，它们使用随机引物、酶法加尾、rRNA去除等策略扩大可观察RNA范围，但不同方法各有捕获偏差，且检测到非编码RNA并不自动证明其功能或预测价值。
2.4. Long-Read Sequencing and Single-Cell Multi-Omics
长读长测序（PacBio、Oxford Nanopore）可提供全长或近全长cDNA的异构体结构信息，例如ScISOr-Seq、R2C2、MAS-ISO-seq和HIT-scISOseq，但继承了上游poly(A)捕获限制，且每细胞信息利用率和成本仍受限。单细胞多组学方法如CITE-seq、sci-CAR、SHARE-seq和TEA-seq可在同一细胞中联合测量RNA与表面蛋白或染色质可及性，但其RNA组分多基于poly(A)计数，总RNA测序可作为更完整的中间层。
3. AI-Enabled Virtual-Cell Models Based on Single-Cell Omics
虚拟细胞模型将单细胞组学数据作为输入而非完整细胞实例。模型能学习统计关联并可能预测未测量性质，但需在保留的生物学环境与干预条件下独立评估。
3.1. From Expression Matrices to Latent Cell States
生成模型如scVI、scANVI和totalVI利用变分自编码器将原始计数和协变量映射为潜在细胞状态，支持数据整合、聚类、差异表达和不确定性估计。但潜在状态仅捕获测量数据中的统计结构，不应自动被诠释为因果调控变量。
3.2. Gene Regulatory Networks: From Association to Candidate Causal Edges
SCENIC通过共表达和基序富集构建转录因子调控子；SCENIC+整合染色质可及性推断增强子驱动的调控子；CellOracle用回归估计上下文特异性调控系数并模拟转录因子扰动。这些方法生成候选调控边，但并非直接证明物理结合或因果调控，需要干预和正交证据验证。
3.3. Dynamic Cell Models: Inferring Future Directions from Static Snapshots
RNA velocity利用未剪接与剪接RNA比值推断瞬时变化方向；scVelo采用动力学模型放松稳态假设；Dynamo结合代谢标记估计矢量场；CellRank将局部速度转化为全局命运概率；Waddington-OT使用最优传输关联相邻时间点的细胞分布。这些方法从破坏性快照推断动态，依赖模型假设并需时间线或谱系验证。
3.4. Perturbation-Response Models: A Predictive Test for Virtual Cells
Perturb-seq提供扰动身份与单细胞转录响应的配对数据。CPA通过对抗训练分离基态并组合扰动、剂量和协变量生成预测；GEARS利用图神经网络推广到多基因组合。评估显示高相关可能部分来自共享反应，简单基线可匹配复杂模型，因此需以扰动身份、细胞上下文和基因组合定义保留测试。
3.5. Single-Cell Foundation Models: Large-Scale Pretraining and Its Limits
Geneformer采用秩次编码和BERT架构预测掩码基因；scGPT将表达值离散化并加入条件信息；scFoundation使用非对称编码器-解码器进行深度感知的掩码重建；CellFM在约1亿细胞上大规模预训练。这些模型主要学习poly(A)基因计数矩阵中的规律，零样本评估并不总优于scVI或Harmony等较简单方法，参数规模与训练细胞数不自动保证泛化能力。
4. How Single-Cell Whole-Transcriptome Detection Could Inform Predictive Virtual-Cell Models
扩展RNA捕获增加模型可观测的分子信号，但其价值必须通过与匹配基因计数基线的对比来证实。
4.1. From Gene Abundance to Transcript-Resolved State Variables
VASA-seq等总RNA方法提供较均匀的基因体覆盖并增加非poly(A)RNA检测；单细胞长读长测序揭示细胞类型特异性异构体程序。因此可将虚拟细胞状态从基因丰度矩阵扩展为基因、异构体、剪接位点和RNA生物型的层次化表示，但能否改善预测仍是任务依赖的经验问题。
4.2. Incorporating Non-Coding and Post-Transcriptional Regulatory Features
非编码RNA和RNA结合蛋白构成转录后调节层。总RNA捕获可检测lncRNA、增强子RNA、环状RNA、miRNA以及可变多聚腺苷酸化或转座子表达等特征。然而共检测不建立调控方向或因果效应，需要结合、结合位点或扰动证据支持。
4.3. Providing More Direct Observables for Dynamical Modeling
VASA-seq增加未剪接RNA回收可能有助于RNA速度推断，但未直接测量合成与降解速率。代谢标记方法如scSLAM-seq、NASC-seq、sci-fate和scEU-seq区分新合成与原有RNA，Dynamo可利用这些数据估计矢量场。将总RNA捕获与时间标记结合有望更直接约束RNA动力学，但仍需动力学假设和独立验证。
4.4. Expanding the Feature Vocabulary and Learning Objectives of Foundation Models
基础模型可将特征单元从基因扩展到转录本异构体、剪接位点、poly(A)位点、非编码RNA类别和转座子来源转录本。预训练目标可延伸至异构体使用预测、剪接位点建模、miRNA–target一致性等。但更大词汇不一定带来更好模型，低丰度、多比对、注释不全会引入噪声，需通过特征消融和保留数据验证。
4.5. Redefining Perturbation Responses and Causal Validation
标准3' poly(A)读数本身可能支持poly(A)位点推断，例如CPA-Perturb-seq揭示了3'加工调节因子对poly(A)位点使用的模块化影响。将总RNA或转录本分辨读数加入扰动实验可揭示中间RNA响应，但需使用匹配训练数据和保留扰动进行验证，并分别评估基因丰度、异构体使用、RNA生物型和功能表型。
4.6. Connecting Subcellular Organization, Tissue Space and the Microenvironment
RNA定位影响功能。APEX-seq可映射亚细胞RNA定位，空间总RNA测序可在组织切片中检测非poly(A)、未剪接和病毒RNA并关联病理区域。但总RNA捕获本身不提供亚细胞坐标，需要空间或成像测量，从而构建空间条件虚拟细胞模型。
4.7. Analytical Performance, Standardization and Evidentiary Boundaries
评估总RNA方法需报告rRNA耗竭效率、文库复杂度、非rRNA信息读数比例、RNA生物型特异检出、背景噪声、测序饱和度和每可用细胞成本。比较应采用匹配细胞、等量读数或等量总预算，统一预处理和分析流程，并通过特征消融、保留样本、分布外测试和不确定性校准判断增益。更广泛RNA捕获只有在明确约束下超过匹配基因计数基线，才应视为对虚拟细胞任务有益。
5. Future Perspectives
未来需共同设计分子测量与AI建模，而不是无限增加测量维度。
5.1. Integrating Single-Cell Whole-Transcriptome Detection with Multi-Omics
现有许多多组学方法的RNA组分仍为poly(A)计数，将总RNA读入需要解决细胞通透化、固定和rRNA去除等兼容性问题。可采用桥接细胞和镶嵌设计，如MultiVI所展示的整合策略，但对总RNA输入的适用性尚未验证。跨模态插补结果应视为预测而非直接测量。
5.2. Integrating Broader RNA Features with AI-Based Virtual-Cell Models
未来基础模型可采用层次特征系统，以基因作为稳定上层词汇，同时纳入异构体、剪接位点、poly(A)位点和非编码RNA等更细粒度特征。模型架构可使用模态特异编码器、共享潜在表示和模态特异解码器。训练语料应包括总RNA、长读长、时间标记和扰动数据；评估应留出整个供体、平台或扰动类别，并比较零样本迁移和不确定性校准。
5.3. Integrating Single-Cell Whole-Transcriptome Detection with Spatial Transcriptomics
空间总RNA测序能在组织原位检测非poly(A)、未剪接和病毒RNA，为空间条件虚拟细胞提供输入。空间虚拟细胞模型应表征细胞内RNA状态、局部微环境以及组织尺度信号梯度。但空间共定位不证明细胞间通讯，需结合空间扰动、实时成像或类器官实验验证预测的方向与幅度。
5.4. From Virtual-Cell Models to Entity-Specific Digital Twins
实体特异性数字孪生需要根据来自特定生物实体的重复测量持续更新模型，并产生可测试预测。由于常规单细胞测序消耗细胞，追踪同一物理细胞需要非破坏性测量；对患者应用而言，单次基线转录组不足以构成数字孪生。患者导向流程应结合标准化poly(A)谱分析、任务相关的总RNA/长读长/空间测量、纵向随访和前瞻性验证，同时兼顾隐私、偏差和监管。
6. Conclusions
细胞图谱映射观察到的细胞状态，虚拟细胞模型旨在预测状态如何随条件变化。高通量poly(A)测序提供了细胞广度，但只捕获部分RNA调控；更广泛的总RNA方法增加非编码和未剪接RNA等信号，长读长、代谢标记、空间和多组学提供互补信息。这些额外信号是候选变量，其预测价值需通过匹配比较、特征消融、分布外评估和干预验证来确定。核心进展不是更大的特征集，而是建立可实验检验的RNA调控与动态响应模型。
