石斛碱通过激活KEAP1–NRF2通路并减轻铁死亡相关应激改善顺铂诱导的急性肾损伤

《Antioxidants》：Dendrobine Attenuates Cisplatin-Induced Acute Kidney Injury with KEAP1–NRF2 Activation and Reduced Ferroptosis-Associated Stress

　　

急性肾损伤（AKI）缺乏有效的药物治疗，铁死亡相关的脂质过氧化是肾小管损伤的重要机制。本研究探讨了石斛碱对AKI的保护作用及其机制。研究人员在小鼠顺铂诱导的AKI模型和肾脏缺血再灌注（I/R）模型中评估了石斛碱的作用，并在顺铂和erastin处理的HK-2细胞中进行了功能、组织学、生化和分子分析。石斛碱改善了肾功能，减轻了肾小管损伤，降低了氧化应激和脂质过氧化，并维持了顺铂诱导的AKI和肾小管细胞中GPX4/SLC7A11抗氧化防御系统。石斛碱还减轻了erastin相关的脂质过氧化和谷胱甘肽耗竭，支持其对铁死亡相关氧化还原应激的作用。在肾脏I/R模型中观察到了一致的肾脏保护效果。在机制上，靶点结合和蛋白质相互作用分析支持石斛碱与KEAP1的细胞结合，并显示KEAP1–NRF2结合减少和NRF2泛素化降低，同时伴随NRF2稳定性和核积累增强。NRF2抑制减弱了石斛碱的保护作用。此外，KEAP1 R415A突变减弱了石斛碱相关的KEAP1结合、NRF2激活和细胞保护，支持Arg415对这些反应的功能贡献。综上所述，这些发现表明KEAP1–NRF2调控的抗氧化防御是石斛碱介导的针对AKI中肾小管损伤和铁死亡相关应激保护的重要组成部分。

研究背景与目的

急性肾损伤（AKI）是一种常见且危及生命的临床综合征，可由肾毒性暴露、炎症或缺血再灌注损伤（IRI）引起，住院患者发病率约10–15%，重症患者超过半数，且与死亡率增加、住院时间延长及后续慢性肾病风险升高相关。顺铂诱导的肾毒性是限制其临床应用的主要挑战。尽管对AKI发病机制的认识取得显著进展，有效药物疗法仍然有限。铁死亡是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，其特征为脂质过氧化过度和抗氧化能力受损，已被证实是肾小管损伤的重要机制。KEAP1–NRF2通路是细胞氧化还原稳态和铁死亡抵抗的核心调节枢纽。石斛碱是从金钗石斛中分离的一种倍半萜生物碱，具有抗氧化、抗炎和神经保护活性。基于上述背景，研究人员独立开展本研究，旨在探讨石斛碱在AKI中的潜在保护作用及其机制，重点关注KEAP1–NRF2信号通路、NRF2依赖性抗氧化防御及铁死亡相关应激。

主要技术方法

研究人员建立了小鼠顺铂诱导AKI模型（C57BL/6J小鼠，腹腔注射顺铂25 mg/kg单次给药，石斛碱20 mg/kg每日一次腹腔注射，第3天处死）和肾脏缺血再灌注（I/R）模型（双侧肾蒂夹闭30分钟，再灌注24小时）。体外实验采用人肾近端小管上皮细胞系HK-2细胞，分别使用顺铂和erastin诱导损伤。关键技术包括：分子对接预测石斛碱与KEAP1的结合模式；细胞热转变分析（CETSA）和药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS）实验评估细胞水平靶点结合；免疫共沉淀（Co-IP）检测KEAP1–NRF2相互作用及NRF2泛素化水平；免疫印迹、免疫组化、生化检测（MDA、GSH、SOD、Fe²⁺）、荧光探针（DCFH-DA检测ROS、BODIPY 581/591 C11检测脂质过氧化、JC-1检测线粒体膜电位）等分析氧化应激和铁死亡相关指标。

研究结果

3.1 石斛碱保护小鼠免受顺铂诱导的急性肾损伤

在顺铂诱导AKI模型中，石斛碱显著降低血清肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）水平，改善肾功能。H&E和PAS染色显示石斛碱明显减轻顺铂引起的肾小管损伤（刷状缘丢失、管腔扩张、蛋白管型和肾小管坏死），降低肾损伤分子-1（KIM-1）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）的表达，并减少TUNEL阳性细胞和cleaved caspase-3表达，抑制凋亡。石斛碱还减少了F4/80阳性巨噬细胞浸润和促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达，发挥抗炎作用。

3.2 石斛碱减轻顺铂诱导AKI中与铁死亡相关的改变

石斛碱处理降低了顺铂引起的血清Fe²⁺水平和肾脏丙二醛（MDA）含量升高，同时恢复肾脏谷胱甘肽（GSH）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性。免疫印迹和免疫组化结果显示，石斛碱恢复了顺铂降低的GPX4和xCT蛋白表达，并减少了脂质过氧化标志物4-羟基壬烯醛（4-HNE）的积累。

3.3 石斛碱减轻缺血再灌注诱导的AKI中的肾损伤

在肾脏I/R模型中，石斛碱同样改善了肾功能指标（Scr和BUN），减轻了肾小管损伤评分，降低了KIM-1和NGAL表达，并恢复了GPX4和xCT的表达，提供了支持性证据。

3.4 石斛碱减轻肾小管上皮细胞中铁死亡相关损伤

在HK-2细胞中，石斛碱（1.25–160 μM）无明显细胞毒性，并剂量依赖性地恢复顺铂降低的细胞活力。石斛碱逆转了顺铂引起的MDA升高和GSH降低，减少了细胞内ROS积累和脂质过氧化（BODIPY C11荧光位移），恢复了GPX4和xCT蛋白表达，并改善了线粒体膜电位（JC-1红绿荧光比值）。

3.5 石斛碱保护HK-2细胞免受erastin诱导的铁死亡相关损伤

在erastin诱导的HK-2细胞损伤模型中，石斛碱恢复细胞活力，效果与铁死亡抑制剂ferrostatin-1相当。石斛碱恢复了erastin耗竭的GSH，减少了ROS和脂质过氧化，并恢复了GPX4和xCT表达。

3.6 NRF2抑制减弱石斛碱介导的抗铁死亡相关应激保护

石斛碱促进NRF2核转位。NRF2抑制剂ML385减弱了石斛碱的保护作用，表现为细胞活力下降、MDA升高、GSH降低，NRF2活化及GPX4和xCT表达恢复被削弱，ROS和脂质过氧化增加，线粒体膜电位保护作用减弱。

3.7 石斛碱结合细胞KEAP1并抑制NRF2泛素化

分子 docking 预测石斛碱与KEAP1 Kelch结构域结合，并识别Arg415为候选相互作用残基。CETSA显示石斛碱增加KEAP1的热稳定性，DARTS显示石斛碱减少KEAP1的蛋白酶敏感性，支持细胞水平的KEAP1结合。Co-IP表明石斛碱减少KEAP1–NRF2相互作用，并降低NRF2泛素化水平。

3.8 Arg415参与石斛碱介导的细胞KEAP1结合及抗铁死亡相关应激保护

与野生型KEAP1相比，R415A突变减弱了石斛碱对KEAP1热稳定性和蛋白酶抗性的影响，减弱了石斛碱恢复细胞活力、减少ROS和脂质过氧化的保护作用。

3.9 Arg415参与石斛碱介导的KEAP1–NRF2信号调控

R415A突变减弱了石斛碱促进的NRF2核积累、GPX4和xCT表达恢复、KEAP1–NRF2相互作用减少以及NRF2泛素化降低。

讨论与结论

讨论部分指出，铁死亡是肾毒性及缺血性AKI中肾小管损伤的重要组分。石斛碱通过恢复GSH、维持GPX4和SLC7A11/xCT表达、减少脂质过氧化，在顺铂和erastin损伤模型中均表现出抗铁死亡相关氧化还原脆弱性的作用。NRF2作为氧化应激适应和铁死亡敏感性的核心调节因子，石斛碱通过结合KEAP1、减少KEAP1–NRF2结合和NRF2泛素化、促进NRF2核积累，从而激活下游抗氧化防御。R415A突变实验结果支持Arg415在石斛碱介导的KEAP1–NRF2通路调控中的功能贡献。研究局限性包括：石斛碱的药代动力学特性、肾脏分布和生物利用度尚需确定；石斛碱是否在不影响顺铂抗肿瘤活性的前提下减轻肾毒性有待验证；铁死亡在顺铂模型中是否为石斛碱保护作用的因果机制需进一步通过遗传学手段确认；Fe²⁺测量反映循环变化而非肾脏铁含量；肾小管特异性基因操作可提供更强的体内因果证据；I/R模型中KEAP1–NRF2信号和铁死亡的贡献尚未充分阐明。

结论部分：研究人员的发现将石斛碱确定为一种潜在的针对顺铂诱导AKI的肾脏保护剂。石斛碱减轻肾小管损伤和氧化脂质损伤，同时维持SLC7A11/xCT–GSH–GPX4抗氧化防御系统。在机制上，石斛碱结合KEAP1并促进NRF2稳定化和抗氧化激活，其中KEAP1 Arg415在肾小管细胞中对这些反应具有贡献。这些效应伴随铁死亡相关应激的减轻，支持KEAP1–NRF2信号作为石斛碱介导的肾小管保护的重要组成部分。石斛碱还在肾脏I/R损伤中提供支持性肾脏保护，但该环境下的潜在机制仍有待确定。总之，这些发现为进一步研究石斛碱作为AKI和铁死亡相关肾损伤的潜在治疗策略提供了依据。