脂肪间充质干细胞外泌体减轻小型猪肝脏缺血再灌注损伤：铜相关改变与铁死亡相关反应潜在关联的药理学证据

《Antioxidants》：ADSCs-Exo Attenuate HIRI in Miniature Pigs: Pharmacological Evidence for a Potential Association Between Copper-Associated Alterations and Ferroptosis-Related Responses

　　

摘要专业翻译 肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）涉及多种形式的调节性细胞死亡，但铜相关改变与铁死亡相关反应之间的关系仍未完全阐明。本研究探讨了在HIRI过程中，细胞内铜稳态的药理学调节是否伴随铁死亡相关反应的相应变化，反之亦然，并评估了脂肪间充质干细胞来源外泌体（ADSCs-Exo）在氧糖剥夺/复氧（OGD/R）和HIRI条件下能否减轻损伤相关改变。研究人员对原代仔猪肝细胞进行氧糖剥夺/复氧（OGD/R）处理，随后对铜稳态和铁死亡相关反应进行双向药理学调节。在结合部分肝切除的腹腔镜小型猪HIRI模型中进一步评估了主要反应模式。OGD/R诱导铜和铁稳态失衡、线粒体功能障碍、氧化还原失衡、铜死亡相关标志物改变以及铁死亡相关变化。与OGD/R组相比，ADSC-Exo处理减轻了这些损伤相关异常。药理学降低细胞内铜负荷伴随Fe2+蓄积减少以及GSH、AIFM2、SLC7A11和GPX4的恢复，而增加铜负荷则产生相反模式。相反，药理学增强铁死亡相关反应增加了Cu2+蓄积并加重了铜死亡相关标志物SLC31A1、FDX1、LIAS和DLAT的改变，而药理学抑制铁死亡相关反应则减轻了这些变化。这些双向药理学反应模式与铜相关改变和铁死亡相关反应之间存在潜在相互关联的结论一致，但并未确立真正的铜死亡、直接分子相互作用或靶点特异性因果关系。在小型猪中，HIRI伴随肝损伤、线粒体功能障碍、肝脏铜蓄积、铜死亡相关标志物改变、铁死亡相关变化以及GPX4表达降低。与未经处理的IRI动物相比，ADSC-Exo给药与这些损伤相关异常的减轻相关。GPX4、TAX1BP1和MAP1LC3B的协调变化具有假说生成性质，支持TAX1BP1/MAP1LC3B相关自噬过程可能有助于GPX4稳态的工作假说；然而，自噬流、GPX4周转以及TAX1BP1–GPX4直接相互作用均未进行评估。由于未纳入非损伤ADSC-Exo单独对照组，本研究无法确定ADSCs-Exo在基线条件下的独立效应。因此，所观察到的ADSC-Exo相关效应应仅在本研究考察的OGD/R和HIRI情境中进行解读。

论文解读

一、研究背景与科学问题

肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）是肝移植和肝切除手术中的重大并发症，以氧化应激、线粒体功能障碍、炎症及多种形式的调节性细胞死亡为主要特征。铁死亡是一种铁依赖性调节性细胞死亡形式，由铁蓄积和脂质过氧化驱动，已被公认为HIRI的重要致病机制。铜死亡是近年来新发现的一种铜依赖性调节性细胞死亡形式，其特征是脂酰化三羧酸循环蛋白被靶向并引发线粒体蛋白毒性应激。已有证据表明铜与铁代谢密切相关，铜失调可通过多种机制影响铁死亡，线粒体功能障碍、谷胱甘肽（GSH）耗竭和GPX4失稳可能构成铜失调与铁死亡相关损伤之间的潜在分子界面。然而，在HIRI过程中铜相关改变是否伴随铁死亡相关反应的相互变化仍不完全清楚。

脂肪间充质干细胞来源外泌体（ADSCs-Exo）因其低免疫原性、生物稳定性和递送生物活性分子的能力而成为有前景的无细胞治疗策略。既往研究包括研究人员自身的工作已表明ADSCs-Exo通过调节脂质代谢、内质网应激、线粒体功能障碍、炎症反应和铁死亡等多种机制改善HIRI。然而，这些研究主要聚焦于单一下游损伤通路或ADSCs-Exo的通路特异性效应。铜稳态与铁死亡相关反应在HIRI过程中是否协调变化，以及ADSC-Exo处理是否伴随这些损伤相关改变的同步减轻，尚未得到充分阐明。为此，本研究采用双向药理学干预策略，探讨铜稳态调节与铁死亡相关反应之间的潜在关联，并评估ADSC-Exo处理在体外OGD/R模型和体内小型猪HIRI模型中的作用。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员首先从18头巴马小型猪（4–6月龄，体重20–25 kg）的腹股沟脂肪组织中分离脂肪间充质干细胞（ADSCs），并通过超滤和超高速离心制备ADSCs-Exo。同一批动物随后被随机分配至假手术组（Sham）、缺血再灌注组（IRI）和外泌体组（Exo），每组6头。原代肝细胞通过Seglen原位两步肝脏灌注法从新生仔猪获得。体外实验采用氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型模拟体内HIRI。研究采用了以下关键技术方法：双向药理学干预策略，使用TTM降低细胞内铜负荷、Cu(II)-Elesclomol增加铜负荷、RSL3增强铁死亡相关反应、PKUMDL-LC-101-D013抑制铁死亡相关反应；CCK-8法检测细胞活力；RT-qPCR检测基因mRNA表达；Western blot检测蛋白表达水平；生化试剂盒检测Cu²⁺、Fe²⁺、GSH、ATP、PDH、线粒体呼吸链复合物I等指标；BODIPY 581/591 C11荧光染色评估脂质过氧化和细胞氧化还原状态；JC-1染色检测线粒体膜电位；免疫荧光染色观察GPX4、TAX1BP1和MAP1LC3B的表达与分布。体内实验采用腹腔镜右半肝缺血60分钟联合左肝叶切除构建HIRI模型，术后经门静脉给予200 μg ADSCs-Exo，于术前及术后第1、3、7天采集血液和肝脏样本。体内生化及分子指标分析采用每组随机选取的3头动物。

三、研究结果

3.1 ADSCs和ADSCs-Exo的鉴定。 分离的ADSCs呈典型纺锤形形态，高表达间充质干细胞阳性标志物CD29、CD44和CD90，低表达阴性标志物CD11b，并具有多向分化潜能。ADSCs-Exo呈典型杯状双层膜结构，高表达外泌体阳性标志物CD63、CD81和TSG101，低表达阴性标志物GRP94，粒径主要集中在30–150 nm范围内。

3.2 原代肝细胞的分离与鉴定。 分离的肝细胞呈不规则多边形形态，细胞间连接紧密，糖原染色阳性和CK-18免疫荧光阳性，证实为高质量的原代肝细胞。

3.3 ADSC-Exo预处理减轻OGD/R条件下的损伤相关改变。 与对照组相比，OGD/R显著降低肝细胞活力并升高ALT、AST、TG和T-CHOL水平；ADSC-Exo预处理显著恢复细胞活力并降低上述损伤指标。

3.4 ADSC-Exo处理与OGD/R诱导的铜相关改变、铁死亡相关变化和线粒体改变的减轻相关。 OGD/R显著增加细胞内Cu²⁺水平，降低SLC31A1、FDX1、LIAS和DLAT蛋白表达；ADSC-Exo处理显著降低Cu²⁺蓄积并恢复上述标志物表达。OGD/R降低ATP、PDH和NADH-CoQ水平，上调DNM1L和FASN，下调MFN2和ACACB，破坏细胞氧化还原稳态并降低线粒体膜电位；ADSC-Exo处理显著改善这些线粒体功能异常。OGD/R增加Fe²⁺蓄积、降低GSH水平，上调TFRC并下调AIFM2、SLC7A11和GPX4；ADSC-Exo处理显著减轻铁蓄积并恢复铁死亡防御系统。

3.5 铜稳态的药理学调节伴随OGD/R诱导肝细胞损伤中铁死亡相关反应的改变。 TTM处理显著降低细胞内Cu²⁺水平，恢复铜死亡相关标志物表达，改善细胞活力、线粒体功能和氧化还原状态，同时降低Fe²⁺蓄积、恢复GSH水平及AIFM2、SLC7A11和GPX4表达。Cu(II)-Elesclomol处理则产生相反效应，进一步增加Cu²⁺和Fe²⁺蓄积，加重线粒体功能障碍和铁死亡相关改变。在OGD/R及OGD/R联合铜负荷情境下，ADSC-Exo处理均伴随上述异常的减轻。

3.6 铁死亡相关反应的药理学调节伴随OGD/R诱导肝细胞损伤中铜稳态和铜死亡相关标志物的改变。 RSL3处理进一步降低细胞活力，增加Fe²⁺蓄积和GSH耗竭，降低AIFM2、SLC7A11和GPX4表达，同时增加Cu²⁺蓄积并加重SLC31A1、FDX1、LIAS和DLAT的改变。PKUMDL-LC-101-D013处理则产生相反效应，恢复铁死亡防御系统、改善线粒体功能，同时降低Cu²⁺水平并恢复铜死亡相关标志物表达。ADSC-Exo处理在相应损伤情境下伴随上述异常的减轻。

3.7 ADSC-Exo处理与小型猪肝脏缺血再灌注损伤模型中损伤相关改变的减轻相关。 在腹腔镜HIRI联合部分肝切除的小型猪模型中，IRI导致血清ALT、AST、T-CHOL和TG升高，肝脏Cu²⁺蓄积增加，PDH水平降低，SLC31A1、FDX1、LIAS和DLAT表达异常，ATP水平下降，线粒体动力学和代谢相关蛋白表达紊乱，Fe²⁺蓄积和脂质过氧化（LPO）水平升高，GSH水平降低，AIFM2、SLC7A11和TFRC表达异常，以及GPX4表达降低伴随TAX1BP1和MAP1LC3B表达改变。ADSC-Exo处理显著减轻上述损伤相关异常，恢复GPX4表达并部分正常化TAX1BP1和MAP1LC3B的表达模式和分布。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，本研究提供了与HIRI期间铜相关改变和铁死亡相关反应之间潜在关联一致的药理学证据。双向药理学干预显示，操纵细胞内铜水平伴随铁死亡相关参数的相应变化，而药理学调节铁死亡相关反应则产生铜稳态和铜死亡相关标志物的相互改变。这些发现与铜相关和铁死亡相关损伤反应之间存在潜在相互关联的结论一致，但并未确立真正的铜死亡、直接双向分子相互作用或靶点特异性因果关系。GSH/GPX4稳态可能构成铜和铁相关损伤反应之间的汇聚点。研究人员基于GPX4、TAX1BP1和MAP1LC3B的协调表达模式提出工作假说，即TAX1BP1/MAP1LC3B相关自噬过程可能参与HIRI期间GPX4稳态的调节，但自噬流、GPX4周转和TAX1BP1–GPX4直接相互作用均未评估，该假说有待直接验证。在OGD/R和HIRI模型中，ADSC-Exo处理均伴随多种损伤相关异常的减轻，但未纳入非损伤ADSC-Exo单独对照组，因此无法确定ADSCs-Exo在基线条件下的独立效应。体内生化及分子指标分析采用每组3头动物，统计精度和推广性受限，结果应视为探索性发现。

研究结论：本研究提供了与OGD/R诱导肝细胞损伤中铜相关改变和铁死亡相关反应之间存在潜在相互关联一致的药理学证据。药理学操纵细胞内铜稳态伴随铁死亡相关参数的相应变化，而药理学调节铁死亡相关反应则伴随铜稳态和铜死亡相关标志物的相互改变。线粒体功能障碍、氧化还原失衡和GSH/GPX4稳态受损可能构成这些损伤反应之间的潜在汇聚点。在本研究考察的OGD/R和HIRI模型中，ADSC-Exo处理伴随铜蓄积、铜死亡相关标志物改变、线粒体功能障碍、铁蓄积、脂质过氧化、GSH耗竭、铁死亡防御系统损伤和肝细胞损伤的减轻。由于未纳入非损伤ADSC-Exo单独对照组，这些发现不能确定ADSCs-Exo在基线生理条件下的独立效应，应仅在本研究考察的损伤情境中进行解读。从转化医学角度看，在结合肝脏缺血再灌注与部分肝切除的大型动物模型中观察到的处理相关减轻效应可能与肝移植和重大肝切除期间遇到的肝损伤相关，但这些发现仍处于临床前阶段。此外，由于未直接评估铜死亡的典型标志物，本研究结果应被解读为涉及铜死亡相关标志物的铜相关改变的证据，而非真正铜死亡的确定性证明。需要进一步的遗传学、靶点特异性、铜死亡特异性和充分把握度的研究来确定因果分子关系并更精确地界定ADSCs-Exo的损伤情境依赖性效应。