《Pharmaceutics》：The Application Potential and Future Challenges of Plant-Derived Exosome-like Nanoparticles in the Treatment of Liver Diseases
肝脏疾病是严峻的全球健康挑战，其高发病率和死亡率给社会带来显著的社会经济压力。尽管治疗取得了进展，但现有治疗方案受到快速耐药和靶向精度不足的限制，亟需新方法。植物源外泌体样纳米颗粒（PELNs）作为一种有前景的天然纳米治疗平台，具有低免疫原性、高生物相容性和在生物体液中长期稳定性等优势。研究人员综述了PELNs的生物学来源、基本性质和关键制备技术，并阐明了其在常见肝脏疾病中的作用机制和治疗用途。研究人员分析了其多靶点肝脏保护机制，包括肝脏特异性靶向通路以及减少关键炎症和抗氧化级联反应。研究人员总结了不同PELNs在主要肝脏模型（包括肝细胞癌、肝纤维化、酒精相关肝病和急性肝衰竭）中的治疗表现，突出了关键植物来源、主要生物学效应和精确分子通路。此外，本工作的重要方法论贡献之一是提出了一种基于差速离心和密度梯度离心的新推荐提取框架，专门针对不同植物组织类型（叶、根/茎和果实）进行优化，以最小化技术异质性。最后，研究人员讨论了阻碍这些纳米囊泡临床转化的主要挑战，包括机制尚未完全阐明、生产工艺不完善以及安全性评价机制不足，为未来在肝病领域的应用指出了重要且有用的方向。
**1. 引言**
肝脏疾病（包括肝细胞癌、肝纤维化、急性肝衰竭、代谢功能障碍相关脂肪性肝病、酒精相关肝病和病毒性肝炎）是重大的全球健康负担。现有治疗在晚期肝细胞癌中常因肿瘤微环境重塑导致的快速耐药而失效，慢性肝纤维化缺乏靶向致病细胞的有效疗法。细胞外囊泡（EVs），特别是外泌体，具有跨生物屏障运输信号蛋白、核酸和生物活性分子的能力。哺乳动物来源的外泌体（如间充质干细胞外泌体）显示出肝保护能力，但受限于大规模生产困难、高成本和潜在免疫原性。植物源外泌体样纳米颗粒（PELNs）因其低免疫原性、高生物稳定性和内在治疗活性而成为有吸引力的替代方案。目前缺乏统一的PELNs分离纯化标准协议，植物组织刚性和物种间异质性限制了数据可重复性。
**1.1 PELNs的特征与生物发生**
**1.1.1 PELNs的分类与命名**
PELNs可根据植物来源分为水果、蔬菜和药用植物来源；也可根据分离纯化方法分类。术语“植物细胞外囊泡（PEVs）”指从植物细胞胞外环境（如叶片分泌物或根部分泌物）通过组织匀浆分离的囊泡；“植物源纳米囊泡（PDNVs）”指通过破坏性方法（如组织匀浆）提取的整个囊泡群体。进一步纯化的产物称为植物脂质来源纳米囊泡（PLNVs）。本文统一采用“植物来源+PELNs”的命名格式。
**1.1.2 PELNs的表征**
物理性质方面，透射电子显微镜（TEM）下PELNs呈球形或椭球形，冷冻电镜（cryo-EM）确认主要为规则球形。粒径分布存在争议，范围从30 nm至1000 nm，或更窄的50–500 nm。Zeta电位通常为负值，但在极酸环境中可呈弱正电荷（如姜来源PELNs在胃液中为+0.26 mV）。化学组成方面，PELNs膜富含磷脂酸（PA）、磷脂酰胆碱（PC）、双半乳糖二酰甘油（DGDG）和单半乳糖二酰甘油（MGDG）等植物特异性脂质，未检测到胆固醇。核酸成分包括mRNA、miRNA、siRNA和其他非编码RNA。蛋白质组高度复杂，已发现1843种蛋白质，但缺乏通用的全植物囊泡生物标志物。此外，PELNs选择性富集姜黄素类、类胡萝卜素和黄酮类等药理活性次级代谢物。
**1.2 PELNs的生物发生**
目前认为主要有三条途径：经典多囊体（MVB）途径、植物特异性外囊泡阳性细胞器（EXPO）途径和液泡途径。值得注意的是，当前提取方案依赖剧烈机械破坏，回收的分离物不可避免地包含真正的细胞外囊泡和由破碎细胞内细胞器形成的人工膜囊泡的异质混合物，因此这些途径应被严格解释为“特定植物细胞外囊泡群体的推定生物发生途径”。
**1.2.1 MVB途径**
MVB途径与哺乳动物外泌体产生类似，始于质膜内吞形成早期内体，成熟为晚期内体或MVB，通过限制膜内陷产生腔内囊泡（ILVs）。该过程依赖转运所需内体分选复合物（ESCRT）及非ESCRT依赖机制。成熟MVB可与质膜融合释放ILVs作为PELNs。最近研究揭示了ARM型E3泛素连接酶SAUL1和AtPUB43在病原感染期间控制MVB锚定至质膜。
**1.2.2 其他生物发生途径**
EXPO途径是植物特异性非经典分泌途径，EXPO是双膜结合细胞器，其外膜可与质膜融合释放内部单膜囊泡至细胞壁空间。还存在通过液泡介导的间接释放可能性，但分子机制尚不完全清楚。
**2. PELNs的提取**
植物细胞壁的独特结构和次级代谢物复杂性对提取方案标准化构成障碍。常用方法包括超速离心、尺寸排阻色谱和聚合物沉淀，各有利弊。
**2.1 植物预处理**
机械破碎法适用于细胞壁脆弱、含水量高的薄壁组织（如果实、茎和叶），包括液氮研磨法。组织浸润提取法适用于低含水量、质地坚韧的组织（如根系），通过真空浸润和低速离心收集植物汁液。酶预处理使用果胶酶和纤维素酶水解释放原生质体。高压均质利用剪切力和空化效应高效破碎。冻融循环通过冰晶剪切力裂解细胞，但需严格优化循环次数和温度参数。
**2.2 PELNs的分离技术**
**2.2.1 超速离心技术**
差速超速离心（dUC）通过逐步增加离心力依次去除死细胞、大碎片和细胞器，最终在≥100,000× g沉淀PELNs。密度梯度超速离心（DGUC）使用蔗糖或碘克沙醇梯度，在12–18小时内使纳米颗粒分布于等密度区（1.10–1.19 g/mL），实现高纯度分离。
**2.2.2 超滤技术**
超滤（UF）根据分子大小通过半透膜分离，快速且可规模化，但易共保留类似尺寸污染物，常出现膜污染，通常用于初始体积缩减而非独立纯化步骤。
**2.2.3 尺寸排阻色谱**
尺寸排阻色谱（SEC）利用多孔凝胶珠根据流体动力学体积分离颗粒，避免超速离心的强烈剪切力，有效保持PELNs的天然结构和活性。微流控芯片SEC（μSEC）可实现小型化和自动化。
**2.2.4 聚合物沉淀法**
使用亲水性聚合物（如聚乙二醇，PEG）夺取囊泡周围水化层，降低溶解度并诱导聚集沉淀。操作简单、高通量，但可能残留聚合物涂层，掩盖膜蛋白。常与其他纯化技术联用。
**2.2.5 免疫亲和捕获**
免疫亲和捕获（IAC）利用特异性抗体识别囊泡表面抗原，具有高选择性。然而，PELNs尚未发现独特的通用表面标志物，植物四旋蛋白（如TET8）抗体和Tim-4蛋白（识别磷脂酰丝氨酸）策略的效率和广谱性尚待验证，严重限制其大规模应用。
**2.3 方法学比较及其对PELNs性质的影响**
尚无单一分离方法能完美平衡产量、纯度和可扩展性。UF和PEG沉淀易共分离非囊泡大分子，DGUC和IAC纯度高但回收率低、可扩展性差。dUC的强剪切力和超高速离心可能破坏脂质双层，PEG沉淀残留聚合物可掩盖膜蛋白，IAC洗脱缓冲液易使表面抗原变性。联合提取策略（如UF结合SEC）正被越来越多地接受。
**3. 基于植物组织类型的推荐提取策略**
植物组织的极端异质性对标准化构成挑战。该框架基于现有方法优势综合而成，需经验验证。
**3.1 组织间差异对PELNs提取的影响**
木质化组织（如成熟茎和根皮）沉积木质素形成坚固次生细胞壁，需更强物理破碎或酶消化。肉质果实富含糖、有机酸和高黏度多糖，会阻碍超速离心沉淀。低水分木质茎需大量缓冲液，稀释PELNs浓度。
**3.2 推荐提取策略**
**3.2.1 叶片组织**
叶片细胞壁较薄均一，主要污染物为叶绿体、多酚和蜡质角质层。推荐液氮研磨或冰浴匀浆（预冷PBS或Tris-HCl，1:3至1:5 w/v，30秒脉冲重复2–3次）。严格采用4 °C顺序差速离心：低速（500–3000× g，10–30 min）去除未破碎组织；中速（10,000× g，20–40 min）去除叶绿体、线粒体和核碎片；过滤后超速离心（100,000–150,000× g，60–120 min）沉淀PELNs。最终通过不连续蔗糖密度梯度（8%、30%、45%、60% w/v）超速离心（100,000–200,000× g，16–18 h），在30%–45%蔗糖层（密度1.10–1.19 g/mL）回收高纯度PELNs。
**3.2.2 植物根和茎**
成熟高度木质化组织需强力机械破碎或高压均质。富含黏液或树脂的组织需增加缓冲液稀释比（至1:10 w/v）并加入黏液溶解剂（如二硫苏糖醇，DTT）或使用微酸性缓冲液降低黏液溶解度。初始离心时间延长至5000× g 30–40 min；富含淀粉粒或脂质体的组织需加强中间离心至15,000–20,000× g 30–45 min；最终超速离心延长至90–120 min或增至150,000–200,000× g。除蔗糖密度梯度外，SEC特别适用于去除多糖和黏液等大分子杂质。
**3.2.3 植物果实**
果实含水量高，可直接压榨。厚皮果实可分离果肉和果皮。果汁需经5000–8000× g离心20–30 min进行初步澄清。由于果实中可溶性蛋白和脂蛋白含量高，超速离心后进行蔗糖密度梯度离心以分离PELNs与脂蛋白复合物和糖蛋白。
**3.3 PELNs表征与验证方案**
根据细胞外囊泡研究最小信息（MISEV）指南，需采用多种互补方法表征。纳米颗粒跟踪分析（NTA）和动态光散射（DLS）用于评估颗粒浓度和水动力学尺寸分布（通常主峰在50–200 nm）。TEM和cryo-EM直接可视化双层膜结构，cryo-EM保持天然水合状态。Zeta电位分析评估分散稳定性，稳定负表面电荷（低于?30 mV）表明聚集可能性低。生化纯度通过检测细胞器特异性蛋白污染物验证，质谱脂质组学和高通量测序（如small RNA-seq）或qPCR表征核酸内容物。
**4. PELNs的研究现状与进展**
**4.1 作为药物递送系统的潜力**
传统合成纳米载体（如脂质体）存在免疫原性风险、脱靶效应和制造成本高等缺点。PELNs作为天然纳米载体具有高生物相容性和低免疫原性风险，可高效包载治疗分子（小分子药物、核酸和蛋白质），并在口服后保护其免遭胃肠道恶劣环境降解。
**4.1.1 药物装载方法**
被动装载（共孵育）利用浓度梯度使药物自发跨膜或插入脂质双层，适合小疏水分子，非破坏性但装载效率低，不适用于大分子或亲水药物。主动装载方法包括超声处理（声穿孔产生瞬时膜孔，装载效率高但可诱导囊泡聚集和表面蛋白变性）、电穿孔（高压电脉冲产生亲水孔，适用于带电大分子如siRNA和质粒DNA，但可能引起囊泡聚集，且成功实例多集中于动物外泌体）、冻融循环（冰晶破坏膜有序结构增加通透性，但物理和热应力较大）。选择装载策略需仔细评估货物类型。
**4.1.2 工程化修饰**
共价表面修饰（如偶联肽、蛋白质、靶向配体或化学化合物）可提高循环稳定性、主动靶向能力，同时赋予荧光成像或光热/光动力效应。例如将PD-L1抗体共价偶联至甘草PELNs产生GP@DMX NV；用透明质酸修饰红甘蓝PELNs以靶向CD44受体。仿生混合膜纳米囊泡（HMNVs）通过融合细菌外膜囊泡（OMVs）与植物纳米囊泡（如菠菜类囊体纳米囊泡）构建，可继承低免疫原性和长循环特性，同时提高肿瘤归巢能力和免疫激活效果。
**4.2 PELNs的基本生物学机制**
**4.2.1 免疫调节与抗肿瘤作用**
PELNs通过调节免疫细胞功能和炎症细胞因子网络实现抗炎效果。例如马齿苋PELNs口服可缓解DSS诱导的结肠炎；大蒜PELNs稳定通过肠道递送功能蛋白和microRNA保护溃疡性结肠炎；地黄PELNs对肺部炎症有疗效；蒲公英PELNs通过调节巨噬细胞M1/M2极化改善过敏性皮炎。抗肿瘤机制方面，青蒿PELNs通过递送内源性植物线粒体DNA（mtDNA）激活肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）中的cGAS-STING信号通路，将促肿瘤M2型重编程为抗肿瘤M1型；柠檬PELNs特异性触发TRAIL/DR5凋亡通路；芦荟、葡萄、大蒜等PELNs通过细胞周期阻滞、凋亡诱导和免疫细胞功能调节发挥抗肿瘤作用。
**4.2.2 抗氧化与组织修复功能**
PELNs通过直接清除活性氧（ROS）、上调内源性抗氧化酶（如超氧化物歧化酶SOD和过氧化氢酶CAT）表达、激活Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）-核因子E2相关因子2（Nrf2）通路来减轻氧化损伤。红甘蓝PELNs降低细胞内ROS水平并改善线粒体功能障碍；人参PELNs通过抑制激活蛋白-1（AP-1）通路保护皮肤细胞免受紫外线和氧化应激诱导的凋亡；香菜PELNs促进细胞迁移并通过上调抗氧化酶表达增强ROS清除。组织修复方面，柠檬PELNs通过调节巨噬细胞极化促进糖尿病伤口愈合；人参PELNs通过调节代谢重编程（上调糖酵解、抑制异常氧化磷酸化）增强内皮功能并驱动血管生成；枸杞PELNs促进成骨细胞增殖分化并加速骨折愈合。
**4.2.3 其他治疗活性**
番茄PELNs通过递送miR-164a/b-5p激活Keap1-Nrf2通路，抑制血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）诱导的血管平滑肌细胞异常增殖和迁移，提示抗动脉粥样硬化潜力。柑橘PELNs调节高脂饮食模型中的肠道菌群组成，减少病原菌并增加有益菌丰度，改善代谢环境。茴香PELNs富含植物铁蛋白，可能为缺铁性贫血提供新治疗选择，但铁蛋白释放的细胞内机制需进一步研究。
**5. PELNs在常见肝脏疾病中的治疗潜力**
**5.1 在常见肝脏疾病中的应用**
**5.1.1 肝细胞癌**
肝细胞癌（HCC）约占所有肝癌病例的90%。大麻PELNs（富含CBD）通过诱导细胞周期阻滞和线粒体介导凋亡抑制肝癌细胞生长。黑桑葚PELNs富含生物活性糖脂和黄酮类，通过半乳糖受体介导内吞靶向肝癌细胞，增加ROS水平导致线粒体功能障碍，抑制增殖和迁移并诱导凋亡；体内通过肠肝循环在肝肿瘤中积累并调节肠道菌群。芦笋PELNs通过吞噬作用进入癌细胞，上调BAX、BAK和AIF表达，激活Caspase-9并裂解PARP诱导凋亡；PEG化修饰延长血液循环时间并结合实体瘤高通透性和滞留效应（EPR效应）增加肿瘤组织积累。
**5.1.2 肝纤维化**
大麻PELNs抑制氧化应激并减少纤维化标志蛋白，对WD/FFC诱导的肝纤维化具有肝保护作用。姜PELNs靶向并改善线粒体功能障碍，有效抑制肝星状细胞（HSCs）活化，延缓肝纤维化进展。蓝莓PELNs通过减轻线粒体氧化应激改善代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MAFLD）。茵陈蒿PELNs减少脂质沉积、改善肝功能并减轻肝纤维化进展，其中鉴定出293个miRNAs，gma-miR5368丰度最高，但具体治疗机制尚需阐明。橘皮、大蒜和柠檬来源PELNs也对肝纤维化和MAFLD显示出治疗功效。
**5.1.3 酒精相关肝病**
石榴PELNs在狂饮酒精诱导的肝损伤小鼠模型中显著降低氧化应激标志物（如CYP2E1、3-硝基酪氨酸）和凋亡相关蛋白水平。葛根PELNs通过增强肝醛脱氢酶（ALDH）活性同时抑制乙醇脱氢酶（ADH），加速有毒代谢物乙醛的清除，并通过抑制铁死亡相关关键蛋白表达，通过促进酒精代谢和抑制程序性细胞死亡双重途径减轻酒精相关肝病（ALD）。姜来源PELNs也证实具有抗酒精性肝损伤活性，可能归因于姜固有的强抗氧化和抗炎成分。
**5.1.4 急性肝衰竭**
金银花PELNs通过调节“肠-肝轴”减轻急性肝衰竭（ALF），可能通过保护肠道屏障功能减轻全身炎症；在脂多糖（LPS）/D-半乳糖胺（D-GalN）诱导的ALF小鼠模型中，口服和静脉给药均显著减轻肝细胞坏死和炎症浸润，降低血清ALT和AST约53%并提高存活率。大蒜PELNs通过抑制NLRP3炎症小体、调节凋亡和焦亡、减少免疫细胞肝脏浸润发挥多方面肝保护作用。葡萄PELNs显著降低血清ALT和AST活性并抑制IL-6、IL-1β和TNF-α释放。艾蒿PELNs显著改善肝病理损伤并降低全身炎症细胞因子水平。
**5.2 肝脏疾病中的治疗机制**
**5.2.1 肝细胞靶向机制**
主动靶向指PELNs表面分子与肝脏靶细胞表面同源受体特异性结合，介导识别、黏附和内吞。大蒜PELNs通过与肝癌细胞表面高表达的CD98重链受体结合实现高效细胞摄取。肝脏无唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）可特异性识别末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基，若PELNs表面展示类似聚糖结构，则可能被ASGPR识别实现主动靶向。被动靶向利用肝脏病理特征（如HCC或肝纤维化时局部新生血管通透性增加、淋巴引流受阻）使PELNs外渗并滞留于病变组织，即EPR效应。天然PELNs的物理化学性质未优化，系统研究尚缺乏，但PEG化等表面工程策略可改善EPR介导的肝靶向递送。
**5.2.2 抗炎作用**
艾蒿PELNs抑制TLR4/NF-κB/NLRP3轴减轻炎症和凋亡，同时激活Nrf2-CYP2A5减轻氧化应激，并下调CCL5/7-CCR5和CXCL9/10/11-CXCR3趋化因子轴减少肝脏免疫细胞浸润。MIR2916是TLR4信号级联的重要功能调节因子。大蒜PELNs通过降低血清促炎细胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）抑制NF-κB信号通路，调节凋亡相关蛋白（降低Bax/Bcl-2比值、抑制Caspase-9/3切割），并抑制NLRP3炎症小体组装和激活以减少Caspase-1和IL-18成熟。桑树皮来源ELNs通过激活AhR信号通路促进黏膜屏障功能，提示AhR通路可能是PELNs调节肝微环境的未来研究前沿。
**5.2.3 肝脏抗氧化机制**
姜PELNs中的生物活性化合物姜酚通过TLR4/TRIF通路激活转录因子Nrf2，使其核转位并诱导血红素加氧酶-1（HO-1）等抗氧化基因表达，从源头抑制ROS产生。蓝莓PELNs通过激活Nrf2通路可持续增强肝细胞抵抗氧化损伤的能力。目前PELNs在肝病中抗氧化效应的研究仍处于早期阶段，需进一步筛选具有强抗氧化潜力的不同植物来源PELNs，并探索是否存在Nrf2之外的抗氧化机制（如Keap1非依赖机制）。
**6. 结论与未来展望**
过去二十年，PELNs因其广泛可获得性、制备简便、结构稳定以及内在生物活性和有效药物递送的双重能力，在肝脏疾病中显示出巨大潜力。目前其肝病治疗应用几乎完全依赖临床前体内评估，尚无针对肝脏疾病的临床试验。但已在口服黏膜炎、炎症性肠病和姜黄素结直肠递送等非肝适应症启动了初步临床探索。主要障碍包括：植物物种、品种、生长环境和收获时间的固有变异性导致颗粒理化性质和生物活性批次间差异；缺乏统一制备方案导致不同方法获得的产物纯度和囊泡完整性差异严重；安全性评价机制不完善。解决这些挑战需整合受控农业系统以获取统一基线生物质，优化下游处理，最终建立符合良好生产规范（GMP）的生产框架。人工智能（AI）和机器学习（ML）通过整合多组学数据可挖掘PELNs复杂成分与特定生物效应之间的关联，加速机制阐明；AI驱动的工艺优化可筛选最佳提取参数，实现纯度、产量和成本的智能权衡。纳米技术和合成生物学的进展将为PELNs的工程化修饰（如靶向修饰、智能药物装载）提供精确途径。
