多功能透明质酸（HA）修饰紫檀芪（PTE）纳米脂质体增强真皮递送及细胞外基质（ECM）保护

《Pharmaceutics》：Multifunctional Hyaluronic Acid-Modified Pterostilbene Nanoliposomes for Enhanced Dermal Delivery and Extracellular Matrix Protection

　　

背景：皮肤老化涉及细胞外基质（ECM）退化，包括胶原蛋白丢失以及糖胺聚糖（GAGs）和蛋白聚糖（PGs）稳态破坏。紫檀芪（PTE）具有抗氧化和抗炎活性，但其局部使用受限于水溶性差和皮肤递送有限。研究人员开发了透明质酸（HA）修饰、负载PTE的纳米脂质体（HA-LP-PTE），并评估其与真皮成纤维细胞的关联、皮肤滞留及对ECM相关反应的影响。方法：HA-LP-PTE通过高压微流化制备，并评估粒径、形态、zeta电位和包封率（EE）。采用荧光显微镜检查荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的HA-LP-PTE和未HA修饰的负载PTE脂质体（LP-PTE）的成纤维细胞相关荧光。采用Franz扩散池评估皮肤滞留。在紫外线（UV）照射的离体皮肤和成纤维细胞中，使用染色技术和逆转录定量PCR（RT-qPCR）分析ECM相关变化。结果：HA-LP-PTE平均直径为55.44 ± 0.81 nm，多分散指数（PDI）为0.120 ± 0.009，EE为99.34 ± 0.51%。在4 h时，成纤维细胞相关荧光高于LP-PTE（p = 0.040），并可被游离HA或4 °C孵育降低。12 h后，真皮PTE滞留比游离PTE高4.08倍，比LP-PTE高1.74倍。HA-LP-PTE增加了所检测的六种ECM成分。硫酸软骨素（CS）和perlecan达到协同作用的Q准则，且若干ECM合成相关基因上调。结论：HA修饰改善了PTE递送，优于单独脂质体包封，具有更高的成纤维细胞相关荧光和更高的活性皮肤中PTE滞留。ECM和基因表达结果也表明基质相关活性。HA-LP-PTE可能增强局部PTE递送并减轻UV诱导的ECM丢失。

研究背景与问题：皮肤老化受内在和外在因素影响，细胞外基质（ECM）变化是其主要机制之一。ECM由胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖（GAGs）和蛋白聚糖（PGs）等构成，为细胞提供物理支撑，并参与细胞信号、组织稳态、保湿和弹性维持。皮肤老化时，胶原蛋白和弹性纤维降解、断裂并失去正常组织，HA和硫酸软骨素（CS）等GAGs平衡紊乱，decorin和perlecan等PGs水平降低，导致皱纹、松弛、干燥和弹性丧失。紫檀芪（PTE）具有抗氧化、抗炎和抗衰老活性，可影响氧化应激、炎症、组织结构及衰老相关信号通路，但局部使用受低水溶性、低生物利用度和光诱导反式至顺式异构化限制。现有纳米递送系统仍有皮肤安全性、残留有机溶剂刺激、工业可行性和理化稳定性等问题。HA是皮肤天然存在的线性多糖和真皮主要ECM成分，具有亲水性、生物相容性和可降解性，并可与CD44表达的皮肤细胞如真皮成纤维细胞相互作用。因此，研究人员假设HA修饰可结合脂质体包封与HA的保湿及ECM相关功能，改善PTE递送和真皮滞留。研究人员开发了HA修饰的PTE负载纳米脂质体（HA-LP-PTE），以增强PTE真皮递送并评估其对UV诱导ECM改变的影响。结论显示，HA修饰改善了PTE递送，优于单独脂质体包封，并减轻UV相关ECM改变，支持其作为局部PTE递送系统的进一步开发。

关键技术方法概括：研究人员采用基于专利脂质体技术的高压微流化制备HA-LP-PTE，并以LP-PTE和HA-LP free为对照。表征技术包括动态光散射（DLS）测粒径和PDI、电泳光散射测zeta电位、冷冻透射电镜（cryo-TEM）观察形态、傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析HA与磷脂相互作用，以及高效液相色谱（HPLC）测定包封率（EE）和载药量（DL）。细胞实验使用原代人真皮成纤维细胞，采用FITC标记脂质体、荧光显微镜和ImageJ定量细胞关联。皮肤滞留实验使用冷冻Bama小型猪皮，来源于Beijing Fuhao Experimental Animal Breeding Center（许可号00038561），采用Franz扩散池。ECM实验使用离体皮肤模型，来源于Shaanxi Biocyto General Testing Technology Co., Ltd.，ECM实验皮肤来自单名28岁女性供体腹部皮肤；采用UVA（30 J/cm²）和UVB（50 mJ/cm²）照射，并行免疫荧光、免疫组化和生物素染色。基因表达采用RT-qPCR，以2^–ΔΔCt法计算。

研究结果：
3.1 纳米载体的理化表征：DLS显示三种脂质体粒径约52–56 nm，PDI低于0.3。HA-LP free、LP-PTE和HA-LP-PTE平均粒径分别为54.15 ± 1.03、52.80 ± 0.29和55.44 ± 0.81 nm，PDI分别为0.157 ± 0.020、0.089 ± 0.017和0.120 ± 0.009。HA-LP free和LP-PTE的zeta电位分别为?2.49 ± 0.13和?4.73 ± 0.15 mV，HA-LP-PTE为?15.12 ± 0.22 mV。FTIR显示HA相关谱带及PtdCho极性头基相关谱带位移，而酰基链亚甲基谱带变化较小，提示HA可能作用于PtdCho脂质体亲水界面区域。Cryo-TEM显示HA-LP-PTE近球形、轮廓光滑。稳定性方面，4 °C下HA-LP-PTE粒径由55.44增至60.58 nm，室温30天增至70.09 nm，45 °C下增至279.80 nm但无可见相分离，LP-PTE在同条件下出现可见相分离；?20 °C下两者粒径均明显增加。
3.2 PTE负载脂质体的载药与包封率：HPLC测定显示LP-PTE和HA-LP-PTE的EE分别为97.67 ± 0.75%和99.34 ± 0.51%，DL分别为0.486 ± 0.013%和0.480 ± 0.018%，接近预设PTE投料浓度0.5%。结果表明PTE成功包封，HA修饰未降低包封。
3.3 FITC标记脂质体在成纤维细胞中的细胞关联：MTT显示0.1% FITC标记制剂未降低成纤维细胞活力。荧光显微镜显示细胞相关荧光从0至4 h增加，6 h下降，4 h最高。37 °C下，HA-LP-PTE在4 h的基线调整后平均荧光强度为26.444，显著高于LP-PTE（p = 0.040）。游离HA预处理使HA-LP-PTE降至20.185（p = 0.0093），4 °C孵育降至4.513（p < 0.001）。结果提示HA相关相互作用和能量依赖过程参与细胞关联。
3.4 不同制剂PTE的体外皮肤滞留：游离PTE在SC、活性表皮和真皮中滞留低。LP-PTE显著增加三层皮肤PTE沉积（均p < 0.05）。HA-LP-PTE进一步增加活性皮肤层沉积：活性表皮为0.410 ± 0.050 μg/cm²，约为游离PTE的2.85倍（p < 0.01），为LP-PTE的1.56倍（p < 0.05）；真皮为1.738 ± 0.018 μg/cm²，为游离PTE的4.08倍（p < 0.01），为LP-PTE的1.74倍（p < 0.05）。结果表明HA修饰在保留脂质体渗透优势的同时增加深层皮肤尤其是真皮PTE沉积。
3.5 负载和空白纳米载体对UV照射离体皮肤ECM成分的影响：UV照射导致ECM显著降解，阳性对照维生素C和维生素E可防止大部分丢失。与空白对照（BC）相比，阴性对照（NC）六种ECM成分均降低（均p < 0.01）。HA-LP-PTE所有ECM成分值为0.86–1.25，均高于NC（均p < 0.01），并使弹性蛋白、HA、decorin、CS和perlecan高于BC，但胶原I未完全恢复至BC水平。HA-LP free单独增加弹性蛋白、CS、HA、perlecan和decorin（p值分别为0.035、0.038、0.023、0.017和0.038），提示空白HA载体并非生物学惰性。游离PTE六种ECM成分值为0.72–1.02。HA-LP-PTE各成分均值高于游离PTE，其中CS（p = 0.022）和perlecan（p = 0.007）差异显著。采用改良Jin’s公式计算协同商Q，CS（Q = 1.17）和perlecan（Q = 1.18）为协同，胶原I（Q = 0.95）、弹性蛋白（Q = 0.96）、HA（Q = 0.96）和decorin（Q = 0.92）为加和。
3.6 HA-LP-PTE对ECM合成相关基因表达的影响：0.01% HA-LP-PTE处理原代人真皮成纤维细胞后，RT-qPCR显示COL1A1、ELN、DCN和HSPG2 mRNA水平上调（p < 0.05）；HAS1–3、CHSY1、XYLT1和XYLT2表达也增加（均p < 0.05）。结果提示HA-LP-PTE可能通过转录水平影响ECM合成。

讨论部分总结：讨论指出，脂质体包封改善了PTE递送，HA掺入与更强的成纤维细胞相互作用和更高的活性皮肤PTE滞留相关。粒径、zeta电位和FTIR结果提示HA可能通过非共价作用改变脂质体界面；高EE、低PDI和负zeta电位表明HA-LP-PTE适合进一步作为真皮PTE载体。细胞荧光实验中，HA-LP-PTE在4 h高于LP-PTE，4 °C和游离HA降低信号，提示HA相关相互作用和能量依赖过程，但该竞争实验不能确定具体受体，也不能区分内化与表面结合，需CD44阻断或敲低及直接内化实验验证。皮肤滞留显示LP-PTE在SC较高，而HA-LP-PTE在活性表皮和真皮较高，提示HA修饰可能有利于向更深活性皮肤层分布。ECM实验中，HA-LP-PTE减轻UV诱导的六种ECM成分丢失，HA-LP free也显示非惰性作用，游离PTE部分保护ECM；Q值提示HA载体和PTE对多数ECM成分呈加和贡献，对CS和perlecan可能协同。qPCR结果与组织ECM成分升高的方向一致，提示转录调控参与。研究优势是使用多对照制剂区分脂质体包封和HA载体贡献；局限包括LP-PTE未纳入ECM和基因表达实验，未评估体外释放动力学，未证实CD44机制，主要依赖离体皮肤和培养成纤维细胞，长期安全性、刺激性、药效持续性和体内抗光老化仍待研究；30天稳定性评估未检测PTE含量、EE、降解产物及PTE反式至顺式光异构化。

研究结论翻译：在本研究中，研究人员制备了HA修饰的PTE负载纳米脂质体，作为真皮PTE递送的局部载体。该制剂保持高PTE包封率。与LP-PTE相比，HA-LP-PTE显示略高的成纤维细胞相关荧光，并在活性表皮和真皮中具有更高的PTE滞留。在UV照射皮肤中，HA-LP-PTE增加了所测ECM成分，并且处理真皮成纤维细胞后上调了若干参与ECM合成的基因。总体而言，HA修饰改善了PTE负载脂质体的真皮性能，且未损害药物包封，同时HA-LP-PTE在离体皮肤模型中减轻了UV相关ECM改变。这些发现支持进一步开发HA-LP-PTE用于局部PTE递送，并持续评估其ECM保护潜力。