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摘要专业翻译
基因组工程已推动细胞治疗发生变革，但临床应用仍主要局限于离体（ex vivo）工作流程及后续的过继性细胞回输。这些方法需要昂贵的生产制造，往往依赖病毒载体，并伴随与不期望的基因组改变相关的风险。脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles
摘要专业翻译
基因组工程已推动细胞治疗发生变革，但临床应用仍主要局限于离体（ex vivo）工作流程及后续的过继性细胞回输。这些方法需要昂贵的生产制造，往往依赖病毒载体，并伴随与不期望的基因组改变相关的风险。脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, LNPs）的最新进展使得基因组编辑组分能够直接递送至体内特定细胞群体，从而免除了离体生产制造的需求。多种基于RNA的基因组编辑方法已进入临床试验。然而，当前的体内方法仍主要局限于基因破坏或小规模序列修饰。大片段载荷的常规整合通常需要DNA供体，而DNA供体可能具有免疫原性、核内可及性有限，并构成重大的LNP制剂挑战。当需要表达嵌合抗原受体（chimeric antigen receptors, CARs）等治疗性蛋白时，基于LNP的方法主要递送mRNA，导致瞬时表达，而许多应用需要通过稳定的基因组整合实现持久表达。逆转座子提供了一种解决方案，因为它们天然进化出将RNA模板直接逆转录为染色体DNA的能力。工程化逆转座子衍生平台可从RNA整合多千碱基（multi-kilobase）载荷而无需外源DNA供体。这些平台将持久表达与仅RNA递送相结合，但临床转化需要安全的永久性整合、拷贝数控制、所有必需组分的高效递送以及在疾病相关原代细胞中的充分活性。本综述描述了非LTR逆转座子的类别；考察了其作为基因组编辑工具加以改造的设计原理；并比较了源自R2、LINE-1、Vingi和RTE元件的涌现平台。这些系统支持从自然进化的插入谱（如核糖体DNA（ribosomal DNA, rDNA）位点特异性插入或分散的全基因组整合）到完全可编程插入的多种整合策略。多个基于逆转座子的平台已展示多千碱基载荷插入、人原代T细胞的功能性工程改造以及小鼠或非人灵长类模型中的体内活性，证明了其临床前景。我们还讨论了关键的转化挑战。随着持续优化，基于逆转座子的平台有望弥合瞬时RNA递送与持久基因写入之间的差距，为下一代体内基因药物奠定多功能基础。
论文主体内容专业总结
1. 引言
快速发展的细胞靶向脂质纳米颗粒（tLNP）制剂技术正使基因药物能够在患者体内直接靶向特定细胞群体。通过绕开细胞的分离、工程改造、扩增和回输，体内方法有望缩短生产周期、降低生产成本、提高治疗可及性和特异性，并使患者免于沉重的预处理负担。早期临床研究已初步验证了体内基因组编辑的可行性和安全性，主要集中于肝脏。然而，当前临床项目所实现的编辑结果仍主要局限于基因失活或少量核苷酸的校正。直接在体内进行大治疗载荷的位点特异性整合仍具相当挑战性，但若实现，将开启广泛的治疗应用。
当前的靶向基因插入临床策略可能需要多种递送载体的协调递送，以容纳其分子组分的数量与尺寸，包括携带可编程核酸酶的LNP连同携带供体DNA的腺相关病毒（AAV）或双AAV系统。除双递送载体生产与施用的复杂性外，这些方法仍保留与DNA双链断裂（DSBs）及外源供体DNA使用相关的潜在风险。更新的混合技术如PASTE和PASSIGE将先导编辑与大丝氨酸重组酶相结合，可在不引入位点特异性DSB的情况下实现大DNA载荷的靶向插入。然而，避免核酸酶诱导的DSB本身并不能消除与外源供体DNA相关的安全性和递送挑战。胞质双链DNA可激活先天DNA感应通路，引发炎症反应和细胞毒性。供体DNA也可能在基因组DNA断裂处被捕获，产生含供体片段、串联拷贝或载体骨架序列的非预期插入或异常靶向产物。此外，DNA依赖性插入需要供体的高效核递送以及多种分子组分的协调递送与活性。
逆转座子提供了一种替代策略，因为它们天然进化出将RNA编码的遗传信息直接拷贝至染色体DNA的能力。根据逆转座子家族的不同，整合位点选择可从高度序列特异性到全基因组广泛分散。然而，多种逆转座子衍生系统可在无需递送外源DNA供体进入细胞核或产生DSB的情况下支持多千碱基载荷的整合。其高持续性逆转录酶可直接将RNA编码的治疗性载荷拷贝至基因组，从而避免随机供体DNA整合和先天DNA感应的风险。在胞质递送后，RNA组分被翻译并组装为具有整合能力的核糖核蛋白复合物。重要的是，对于生物技术应用，逆转座子机器的瞬时表达足以产生稳定的基因组整合。基于RNA的递送因此可限制细胞对编辑机器的暴露时长。全RNA逆转座子平台因此特别适合体内基因组工程，因为编辑机器和多千碱基载荷均可通过瞬时的、LNP兼容的RNA形式递送。
2. 逆转座子分支
转座子分为两大类。II类转座子为DNA转座子，通过剪切-粘贴机制移动。I类转座子即逆转座子，通过RNA中间体进行增殖。逆转座子进一步分为长末端重复（LTR）和非LTR逆转座子。LTR逆转座子依赖病毒来源的整合酶，而非LTR逆转座子通过靶向引物逆转录（TPRT）整合。在非LTR逆转座子中，长散在核元件（LINEs）构成主要的自主元件类别，通常大于6 kb，编码自身移动所需的蛋白质。短散在核元件（SINEs）通常小于1 kb，为非自主元件。根据内切酶结构域特征，LINEs可分为两个主要类群：祖先类群编码限制酶样内切酶（RLE），较新进化的类群编码脱嘌呤/脱嘧啶内切酶（APE）。RLE类群包括R2、R4、HERO、CRE和NeSL分支，APE类群包括LINE-1、Vingi、RTE、CR1和Jockey等分支。目前进展最大的是RLE类群的R2分支以及APE类群的LINE-1、Vingi和RTE分支。
3. 基于逆转座子的基因组编辑平台设计原理
3.1 机制
RLE型和APE型非LTR逆转座子使用共同策略在宿主基因组中增殖。逆转座子RNA指导一种含内切酶和逆转录酶结构域的多功能蛋白的合成。该蛋白与逆转座子RNA结合形成核糖核蛋白复合物，随后结合基因组靶位点，内切酶首先切割DNA底链，暴露3′-OH，该3′-OH直接引物化第一链cDNA合成，即靶向引物逆转录（TPRT）。随后切割相对链，产生的基因组3′-OH可引物化互补链合成。逆转座子RT从RNA依赖性转换为DNA依赖性DNA合成，延伸第二DNA链。宿主DNA修复因子最终完成末端加工、缺口填充和连接。
3.2 整合位点
APE型和RLE型逆转座子蛋白具有不同的结构域组织。APE型的内切酶结构域位于N端，后接逆转录酶结构域；RLE型的逆转录酶结构域位于C端限制酶样内切酶结构域之前。RLE蛋白还含有锌指和Myb DNA结合结构域。因此许多RLE逆转座子在特定基因组位点整合，如R2在28S rRNA基因、R7在18S rRNA基因，而APE型如LINE-1和Vingi显示更广泛的靶位点分布。然而位点特异性并不消除对插入拷贝数控制的需求。
3.3 切割模式
逆转录转座过程中DNA切口的位置和时序是重要考虑因素。R2TaGu切割两条DNA链的切口间仅2个核苷酸偏移，LINE-1使用8–12个核苷酸的较大偏移，但两者均可产生DSB。因此使用野生型逆转座子内切酶需要仔细表征切割动力学、基因组缺失、染色体重排等后果。
3.4 活性与蛋白质工程
逆转座子必须在不灾难性损伤宿主基因组的情况下增殖。人类基因组中大多数逆转座子序列是分子化石，天然逆转座子很少具有治疗性基因组编辑所需的活性水平。其活性通常需要通过逆转座子蛋白的理性工程、RNA模板及其结构元件的优化或新功能结构域的添加来改善。
3.5 核糖核蛋白组装与递送形式
逆转座子核糖核蛋白组装机制可强烈影响基因组编辑平台的架构和递送形式。LINE-1的ORF2蛋白在生理温度下不稳定，但结合poly(A) RNA后显著稳定，支持ORF2p在翻译后迅速与其自身RNA的poly(A)尾结合的模型。LINE-1的ORF1p通过围绕LINE-1 RNA形成凝聚体进一步促进顺式偏好RNP组装。维持这种进化的顺式RNA结合偏好可能需要递送含ORF1、ORF2和治疗载荷的单一RNA，可能超过7 kb，这对RNA合成、稳定性、制剂和LNP封装构成重大挑战。相比之下，R2蛋白通过逆转录酶结构域的N端延伸识别R2 3′ UTR中的结构化元件，允许蛋白编码RNA和供体RNA作为独立分子递送，简化系统设计并减小单个RNA组分的尺寸。
3.6 与人类细胞环境的兼容性
逆转座子的进化起源和宿主分布可能限制其在人类细胞中的使用。LINE-1是目前已知在人类中保持活性的唯一自主非LTR逆转座子家族。大多数其他系统源自非人类物种。在改造此类元件用于治疗前，需要确定天然物种中逆转录转座所需的宿主因子在人类细胞中是否保守并发挥类似功能。例如，人Polθ促进R2衍生cDNA的微同源介导连接，而53BP1-shieldin-CST-Polα通路优先支持严重截短的插入。
3.7 免疫应答
非人类逆转座子蛋白的表达必须评估细胞耐受性和免疫原性。外源蛋白和RNA结构可能激活先天免疫通路，而延长或重复表达可能诱导适应性免疫应答。LNP介导的递送可能使肝脏、脾脏和抗原呈递细胞暴露于RNA和非人类逆转座子蛋白，可能触发先天炎症或编辑器特异性适应性免疫应答。
4. 基于RLE的平台
4.1 PRINT（Addition Therapeutics）
精确RNA介导的转基因插入（PRINT）是源自R2逆转座子家族的嵌合工程方法，靶向28S rRNA整合位点。PRINT使用R2-A3分支的鸟类R2元件，为双RNA平台：一个mRNA编码R2蛋白，独立模板RNA携带转基因表达盒。模板RNA以含HDV样自切割核酶的结构开始，自切割产生携带28个核苷酸同源序列的成熟RNA。在RPE细胞中，PRINT介导的GFP表达盒整合产生约35% GFP阳性细胞，使用N1-甲基假尿苷（m1Ψ）替代尿苷后增至约50%。为控制插入负荷，引入了内切酶调谐（ENT）变体，将平均拷贝数降至约2.5。Addition Therapeutics报告了临床前概念验证研究，包括原代人肝细胞和骨骼肌细胞中HIV中和eCD4-Ig生物制品的产生、Fabry病小鼠模型中单次LNP剂量产生持久超生理水平的α-半乳糖苷酶A活性，以及非人灵长类中单次LNP剂量后20周内稳定的血清hEPO水平。
4.2 en-R2Tg系统（中国科学院动物研究所）
en-R2Tg平台源自R2TaGu逆转座子，为双RNA系统，靶向28S rRNA整合位点。通过结构引导工程引入A793V、Q955R和G1098R三个有益替换，并整合两个染色质调节肽。供体RNA通过删除R2TaGu 3′ UTR中的大茎环结构进行优化。这些优化在Huh7细胞中经LNP递送实现24.8%整合效率，供体序列长达2.5 kb时仍保持10%以上效率。小鼠受精卵原核显微注射产生超过60%靶向GFP整合。然而在原代T细胞中，电穿孔后4天整合效率低于1%，凸显了在治疗相关原代细胞中直接优化平台的重要性。
4.3 miniMod供体（麻省理工学院）
Feng Zhang实验室开发了基于R2TaGu的平台。利用R2TaGu的反式作用能力，平台使用独立的编辑器和供体RNA。编辑器RNA编码人密码子优化的R2TaGu蛋白。供体RNA被广泛最小化：去除整个R2TaGu 5′ UTR，替换为含锁定核酸加帽类似物和五个2′-O-甲基修饰核苷酸的抗降解5′修饰。当编辑器与miniMod供体RNA共封装于SM-102 LNPs时，HEK293FT细胞中超过90%检测到功能性GFP整合，但早期估计每基因组约3.3个全长转基因拷贝，随后GFP阳性比例下降，表明高编辑细胞被反向选择。将编辑器与供体重量比从1:1改为1:4可减少编辑器暴露并改善转基因持久性。miniMod在肌管和有丝分裂后细胞中保持活性，但在原代人T细胞中整合效率低于1%。
4.4 STITCHR（麻省理工学院）
STITCHR方法将R2元件与CRISPR-Cas9切口酶融合，实现可编程载荷整合。研究显示R2TaGu的RT和RLE活性可反式互补，内部同源臂可将TPRT从天然28S rDNA靶点重定向。Fell等人筛选了单ORF RLE逆转座子并选择R2TaOc，其结合高效重定向与天然28S rDNA位点最小背景插入。STITCHR编辑器包含通过XTEN连接子融合至R2TaOcΔ1–169 N端的SpCas9H840A，分布五个核定位信号。该平台在AAVS1、NOLC1、LMNB1和EMX1等多个内源位点实现整合。在HEK293FT细胞中，STITCHR在NOLC1支持12.7 kb载荷的无疤痕插入，约9%连接阳性编辑，99.92%为完整整合。双载体腺病毒递送在HEK293FT细胞中实现约6%整合，但在静息原代人肝细胞中仅约0.5%精确整合。
4.5 R2 Helper（Typewriter Therapeutics）
Typewriter Therapeutics基于东京大学Fujiwara实验室的R2专业知识，开发R2逆转座子的治疗潜力。其专利组合突出两个鸟类R2直系同源物：R2AcGe和R2MiRu。在反式RNA形式中，编码R2蛋白的helper mRNA与携带GFP表达盒的供体RNA组合。R2AcGe和R2MiRu在HEK293T脂转染实验中分别产生24.5%和约12% GFP阳性细胞。R2AcGe超过99.5%的整合事件发生在预期28S rDNA靶点，并在原代人T细胞和肝细胞中分别产生1.1%和0.56% GFP阳性细胞。
5. 基于APE的平台
5.1 Driver（Averna Therapeutics）
Averna Therapeutics（前Exsilio Therapeutics）公开了两个基于APE型非LTR逆转座子的基因整合平台，用于分散的全基因组整合。第一个使用斑马鱼L2-2元件（L2-2DaRe），第二个使用绿安乐蜥Vingi-1元件（Vingi-1AnCa）。L2-2DaRe系统在U2OS细胞中产生约30% GFP阳性细胞。Vingi-1AnCa平台采用双RNA构型，经LNP递送至活化原代人T细胞后，产生高达59.3% CAR阳性细胞，估计平均每CAR阳性细胞约2.3个拷贝。CAR和TRuC表达T细胞在体外介导NALM6-Luc杀伤，CD3γ-TRuC T细胞在过继转移后抑制小鼠NALM6-Luc白血病。然而非位点特异性整合及可变且有时较高的拷贝数估计需要全基因组插入位点分析。
5.2 Gene Writer（Tessera Therapeutics）
Tessera Therapeutics开发了源自Vingi-1AnCa和RTE-1MoDo的平台，用于分散全基因组整合。两者均以反式方式运作，使用编码基因修饰蛋白的Writer mRNA和携带载荷的独立模板RNA。S-EPTS/LM-PCR在iPSCs中定位了5055个Vingi-1AnCa插入位点，其中43%为基因间、47%为内含子。Vingi-1AnCa在T细胞中产生高达35% GFP阳性，未检测到IFNB1或CXCL10诱导。RTE-1MoDo通常产生比Vingi-1AnCa更高的CAR阳性比例，产生12–20% BCMA-CAR阳性T细胞。RTE-1MoDo UTR通过祖先序列重建和突变筛选优化，将GFP阳性原代人T细胞从约8%提高至14%。在ASGCT 2026，Tessera展示了使用T细胞靶向LNP递送的未公开反式作用非LTR Gene Writer：在PBMC移植NSG肿瘤模型中，单次静脉剂量产生约24% CD19-CAR阳性T细胞；在食蟹猴和恒河猴中，分别产生约60% CAR阳性T细胞峰值，B细胞耗竭持续29至35天，估计每CAR阳性细胞约1.5/2个CAR拷贝。
5.3 RetroT（CREATE Medicines）
RetroT源自CRISPR启用的自主转座元件（CREATE）平台，将LINE-1（L1）逆转座子的天然整合机制与CRISPR Cas9切口酶结合。RetroT使用顺式构型，单一RNA编码编辑蛋白和载荷。RNA含5′ CleanCap结构、人密码子优化的ORF1和ORF2编码序列，由内部核糖体进入位点（IRES）分隔。ORF2p内切酶结构域通过D205A突变失活（dEN）。载荷以反向方向位于ORFs下游，两侧为与预期基因组整合位点周围序列同源的两个75 nt引物结合位点（PBSs）。RetroT RNA与SpCas9(H840A)切口酶和两个向导RNA共递送，产生带游离3′-羟基的单链DNA瓣。在原代人T细胞中，RetroT实现高达12% CD19 CAR阳性细胞，平均每CAR阳性细胞1至2个拷贝，未检测到连接处indels或基因组疤痕。全基因组测序未发现脱靶整合。RetroT生成的CD19 CAR-T细胞在体外表现出抗原特异性细胞毒性，过继转移单剂量105 RetroT工程CAR-T细胞在NALM-6异种移植模型中强效抑制肿瘤生长。
6. 基于逆转座子的基因组编辑的特征与局限性
6.1 全长整合
逆转座子平台的主要局限性是通过逆转录过早终止频繁产生截短整合。R2平台通常显示约50%的截短率，STITCHR除外（超过99.9%为全长）。Vingi-1AnCa Driver平台约25%整合被估计为截短。截短产物对全基因组整合的APE型平台尤为令人担忧，可能破坏编码或调控区域或产生融合转录本。对于靶向28S rDNA阵列的R2平台，截短整合带来将无完整治疗载荷的启动子插入rDNA重复的风险。STITCHR和CREATE-RetroT均报告超过99.9%的完整整合率，表明整合完整性取决于超越内在逆转录酶持续性的因素。两个平台均使用Cas9切口酶产生确定DNA引物并整合广泛的靶标互补序列，可能有利于生产性TPRT启动和整合完成。
6.2 基因毒性
整合拷贝数的精确控制对逆转座子平台的临床开发至关重要。非LTR逆转录转座可在整合连接处引入序列改变，包括非模板化核苷酸、微同源、靶位点重复或缺失，以及较少见的倒位或更大基因组重排。R2蛋白可产生TPRT独立的DSB，过度R2活性可能在rDNA阵列内产生多个损伤，促进重组、染色体不稳定或细胞适应性丧失。编辑暴露与整合效率必须平衡。全基因组整合的APE型平台可能破坏必需基因或肿瘤抑制基因、干扰邻近基因表达或激活原癌基因。基因毒性评估应结合全基因组整合位点作图、整合拷贝数测量、完整插入结构表征和基因组重排分析。
6.3 顺式和反式RNA架构
顺式构型系统如RetroT中，逆转座子编码序列和治疗载荷由同一RNA携带，利用LINE-1蛋白对其编码RNA的偏好，可能有利于翻译位点附近的RNP组装。反式构型系统如PRINT中，编辑器和供体作为独立RNA提供，允许独立调整序列和相对剂量，但需要编辑器蛋白可用性与完整供体RNA库之间的充分时间重叠。顺式架构减少逆转座子RNA种类数量但产生更长分子，增加全长RNA合成、纯化、稳定性和制剂的重要性。反式架构可减少单个转录本长度并允许独立工艺优化。在直接比较中，Ψ或m1Ψ的掺入增加了多个平台在T细胞中的逆转录转座，可能通过增强RNA稳定性、翻译或时间重叠发挥作用。
6.4 适应性免疫应答
活化人T细胞中未检测到先天免疫激活并不排除对编码编辑蛋白的适应性免疫应答。非人类逆转座子蛋白可能引发抗体和T细胞应答。已证明人类中存在对SpCas9和SaCas9的预先存在体液和细胞免疫。RNA的瞬时表达可能限制抗原暴露，但不应假设可防止免疫致敏或免疫介导的编辑细胞清除。评估应从临床相关RNA制剂在原代人靶细胞和外周血单核细胞中的测试开始，包括活力、干扰素应答和细胞因子释放。还应筛查预先存在的抗编辑器抗体和跨多样化HLA背景供体的抗原特异性T细胞应答。免疫活性动物研究应结合早期细胞因子谱与纵向抗编辑器抗体、编辑器特异性CD4+和CD8+ T细胞应答、组织炎症及编辑细胞持久性和功能测量。
6.5 可编程性
实现可编程整合目前需要混合逆转座子-切口酶系统。STITCHR和CREATE-RetroT在基因组整合位点选择方面提供最大灵活性，但增加必须共递送的组分数量和尺寸。先前通过将ORF2p融合至DNA结合结构域来重定向LINE-1整合的尝试未成功。两种替代策略因此出现：利用R2蛋白的内在靶标特异性将载荷整合至多拷贝28S rDNA位点，或使用Vingi-1、L2-2和RTE-1等APE型元件将整合广泛分布于基因组。后者缺乏位点水平控制，但保留相对慢病毒载体的重要优势，即整个系统可配制成RNA封装于LNPs用于体内递送。
6.6 临床应用考虑
逆转座子编辑的临床机会可能取决于每个平台架构与其预期治疗应用的匹配程度。位点特异性系统提供对插入位置的更大控制，可能在需要内源调控、无启动子表达或确定基因组安全港时受到青睐，但通常需要额外靶向组分和更复杂的共递送。广泛整合系统可能更简单并能实现高水平功能性工程，但其临床开发需要对插入位点分布、总拷贝数和克隆拷贝数、不完整产物和长期克隆行为有更深入理解。R2系统通过利用天然偏好的多拷贝位点占据中间位置。这些权衡应在治疗阈值的背景下评估：仅需小部分持久修饰细胞的应用可容忍较低编辑效率以换取更大基因组控制，而细胞治疗应用可能需要更高编辑水平但面临克隆扩增和插入基因毒性的更大担忧。
7. 结论
基于逆转座子的平台可从RNA模板稳定整合多千碱基载荷而无需外源DNA供体，为非病毒体内基因组工程创造机会。本综述涵盖的系统包括rDNA靶向、广泛整合和可编程方法，各具独特优势和局限性。尽管仍存在技术挑战，这些系统已从机制研究迅速进展至原代人细胞和部分平台体内持久基因整合的临床前展示。临床转化的进展将取决于在疾病相关细胞中的可重复编辑、临床意义的功能结果、整合产物和插入位点的全面表征以及体内长期安全性的证据。满足这些要求可使基于逆转座子的平台成为核酸酶、重组酶和病毒载体基因组工程的重要补充，平台选择由每个治疗应用的需求指导。
