单次鞘内递送抗hSOD1 miRNA的rAAV2-Retro在成年SOD1G93AALS小鼠中赋予强效神经保护

《Cells》：Single-Dose Intrathecal rAAV2-Retro Delivering Anti-hSOD1 miRNA Confers Robust Neuroprotection in Adult ALS Mice

　　

肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）在发病后数年即致死，已获批治疗药物仅能有限改变病程。沉默SOD1（superoxide dismutase 1, SOD1）已成为可信治疗路径，但两个缺口制约该策略：缺乏一种可高效转导脊髓且外周转导有限的载体平台，以及缺乏在基因沉默基础上加入神经营养支持是否有效的证据。研究人员构建了用于鞘内递送的rAAV2-retro平台。单次鞘内注射表达eGFP（enhanced green fluorescent protein, eGFP）的载体转导所有脊髓节段和若干脑区，明显偏好脊髓运动神经元，肝和心低表达。在成年小鼠中并列比较，研究人员随后使用该平台在SOD1^G93A动物中比较miRNA（microRNA, 微小RNA）介导的人SOD1沉默、IGF1（insulin-like growth factor 1, IGF1）过表达及两者联合。单次注射携带抗hSOD1 miRNA的rAAV2-retro使中位生存延长25天，改善运动表现，保护神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ），保留α-运动神经元，并抑制胶质增生和凋亡。IGF1单独也延长生存并限制神经元丢失，但未改变运动表现。在测试条件下，IGF1相对于单独miRNA的益处多数终点未观察到；观察到后肢抱拢有适度、名义显著改善，鉴于比较次数，应将其解释为探索性。因此，hSOD1沉默占益处的大部分，在测试条件下未观察到IGF1在hSOD1沉默之上具有统计学可检测的额外益处。因此，单次鞘内剂量的rAAV2-retro-miRNA是SOD1^G93A小鼠模型中的有效基因沉默方法，在C57BL/6J小鼠中观察到肝和心外周转导有限。然而，这些数据也显示在测试条件下通过添加IGF1获得额外益处的困难。

研究背景：ALS选择性破坏运动皮质、脑干和脊髓运动神经元，患者中位生存为症状出现后2–5年，发病率约1–2/10万人年，患病率6–9/10万人年，发病高峰在第七个十年。其机制并非单一病变：蛋白聚集、氧化应激、线粒体失败、谷氨酸兴奋性毒性和持续神经炎症均参与并相互放大。约10%病例为家族性ALS（fALS），90%为散发性ALS（sALS）。SOD1是首个被涉及的家族性ALS基因，仍约占家族性病例的20%，已 catalog 超过200个变异；其机制为毒性功能获得而非歧化酶活性丧失。现有疾病修饰治疗包括riluzole、edaravone和sodium phenylbutyrate–taurursodiol，临床获益有限且不直接靶向遗传病因。RNA干扰（RNA interference, RNAi）或反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, ASOs）抑制SOD1在SOD1-ALS临床前模型有效，tofersen获FDA批准使SOD1成为可干预靶点，但tofersen需反复腰椎穿刺，造成患者负担、脑脊液暴露波动和操作风险。腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）载体可通过一次给药在中枢神经系统持久表达，但AAV9会从脑脊液逃逸入循环并富集于外周组织尤其是肝，可能因免疫激活和肝毒性影响安全性和疗效。因此，能高效转导脊髓且外周泄漏少的衣壳更有利。IGF1具有广泛神经营养活性，可维持运动神经元存活、支持轴突生长和保护肌肉；临床前研究显示IGF1过表达在ALS模型中带来治疗益处，但总体疗效有限。IGF1与SOD1沉默通路不同，联合是否优于单用SOD1沉默尚未系统评价。rAAV2-retro是一种经工程化改造、具备逆向运输和高效脊髓转导能力的AAV变体，其衣壳含细胞穿透肽，可高效逆行轴突运输；既往研究显示其肌内注射后介导强逆行转导，新生小鼠外周给药可高效转导脊髓运动神经元。研究人员此前在新生SOD1^G93A小鼠中肌内注射表达抗hSOD1人工miRNA的rAAV2-retro，获得广泛脊髓转导和显著治疗益处，但成年动物外周路径逆行转导效率明显下降。研究人员推测将rAAV2-retro直接放入脑脊液可绕过外周屏障，恢复成年动物脊髓运动神经元高效广泛转导。因此，研究人员构建携带抗hSOD1人工miRNA和/或IGF1过表达盒的rAAV2-retro载体，并以人工miRNA作为RNAi效应器，因其安全性优于常规短发夹RNA。研究结论显示，单次鞘内rAAV2-retro-miRNA在SOD1^G93A小鼠中有效沉默hSOD1，肝和心外周转导有限，但添加IGF1在测试条件下未显示统计学可检测的额外益处。

关键技术方法：研究使用C57BL/6J小鼠和携带多拷贝人突变SOD1^G93A转基因的SOD1^G93A小鼠，二者均来自Jackson Laboratory（JAX, Bar Harbor, ME, USA），饲养于复旦大学SPF设施。构建四种rAAV2-retro载体：eGFP-Scramble、IGF1-Scramble、eGFP-miRNA、IGF1-miRNA；对8周龄SOD1^G93A小鼠单次鞘内注射2×10¹¹ GC/鼠。生存和行为分析样本量为scramble n=12、IGF1单独n=8、miRNA单独n=8、联合n=13；组织病理分析每组n=5。评价疾病发作、生存、体重、行为学（转棒、握力、肢体抱拢）、复合肌肉动作电位（compound muscle action potential, CMAP）、组织学（免疫荧光、Western blot、ELISA、TUNEL、HE）等。

研究结果：
3.1 鞘内递送rAAV2-Retro介导广泛中枢神经系统转导并具有有限外周脱靶表达。通过成年小鼠单次鞘内注射rAAV2-retro-CAG-eGFP，4周后行免疫印迹和免疫荧光。结论：脊髓所有节段和脑区包括运动皮质、脑干均转导，腰段最高；腰段几乎所有eGFP阳性细胞与胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase, ChAT）共定位；颈、胸、腰段eGFP阳性细胞中ChAT阳性比例分别为95.4±1.72%、94.08±1.34%、96.2±1.30%，ChAT阳性运动神经元中eGFP阳性比例分别为53.35±1.87%、49.60±1.79%、54.98±2.66%。与同路径AAV9相比，rAAV2-retro在肝和心转导显著更低；脊髓节段分布与AAV9相当且腰段富集。

3.2 rAAV2-Retro载体在体内实现高效IGF1过表达和hSOD1沉默。对8周龄SOD1^G93A小鼠鞘内注射四种载体，4周后Western blot和ELISA。结论：miRNA单独和联合组腰段hSOD1蛋白相对scramble分别降低51.3%和52.6%；IGF1单独和联合组IGF1大幅升高。

3.3 miRNA介导hSOD1敲低延长SOD1小鼠生存。60日龄注射，行为测试一周后开始，进行生存分析。结论：miRNA单独和联合组显著延迟疾病发作；中位生存scramble为139.5天，IGF1单独为152天（+9.0%），miRNA单独为164.5天（+17.9%），联合为168天（+20.4%）；miRNA单独与联合无统计学差异；联合显著优于IGF1单独，但不显著优于miRNA单独。生存获益主要归因于miRNA介导的hSOD1沉默。

3.4 miRNA治疗保留SOD1小鼠运动功能。通过前肢和后肢握力、转棒潜伏期、肢体抱拢评分评价。结论：IGF1单独组各项均无显著改善；miRNA单独组显著改善前肢和后肢握力及转棒表现，但肢体抱拢评分未显著降低；联合组在所有四个运动参数上均显著更好；联合与miRNA单独无显著差异，功能获益主要归因于hSOD1沉默。

3.5 miRNA治疗保护NMJ完整性和传递。第130天行NMJ染色、腓肠肌纤维横截面积和CMAP检测。结论：scramble组仅7.6% NMJ完全支配；miRNA单独和联合组支配NMJ比例显著增加、失支配NMJ显著减少；IGF1单独、miRNA单独和联合均显著减轻肌萎缩，miRNA单独和联合保护最强；miRNA单独和联合显著提高CMAP幅度，IGF1单独未提高；miRNA单独与联合无差异。

3.6 miRNA治疗挽救α运动神经元并抑制神经炎症。免疫荧光分析。结论：第130天scramble组腰段α运动神经元数量最低；IGF1单独、miRNA单独和联合均显著增加α运动神经元存活；miRNA单独和联合无显著差异，未观察到IGF1额外益处。miRNA单独和联合显著降低Iba1（小胶质细胞）和GFAP（星形胶质细胞）荧光；IGF1单独未改变二者；miRNA单独与联合无差异。

3.7 miRNA介导hSOD1敲低减少蛋白积累和脊髓凋亡。免疫荧光检测hSOD1和TUNEL染色。结论：第130天miRNA单独和联合组脊髓hSOD1免疫反应仍显著降低，IGF1单独无影响；IGF1单独、miRNA单独和联合均降低TUNEL阳性细胞，miRNA单独和联合最强（p<0.0001），IGF1单独较弱但明确（p<0.01）；miRNA单独与联合在hSOD1降低和TUNEL阳性细胞数上无差异。

讨论总结：研究人员首次在成年SOD1^G93A小鼠中直接比较鞘内rAAV2-retro介导的hSOD1沉默、IGF1过表达及二者联合。miRNA介导hSOD1沉默显著延长中位生存（从对照139.5天至164.5天，+25天），改善运动功能，保护NMJ，限制腰段α运动神经元丢失，并抑制胶质增生和凋亡。IGF1单独也延长生存（中位152天，+12.5天）并保留ChAT⁺神经元，但未改善握力和转棒表现。与预期相反，在miRNA基础上加入IGF1未在任何结局指标上产生统计学显著改善。载体表现良好：单次鞘内给药到达所有脊髓节段和脑区，具强运动神经元嗜性；同路径AAV9在肝和心转导更多，但未进行全面系统生物分布和毒理学评估。讨论提出若干可能解释：二者汇聚于共享下游效应器如Bcl-2家族和caspase级联；IGF1剂量/暴露不足；治疗窗口不同，IGF1可能更适用于更早的无症状阶段，如Baird et al.的新生儿治疗范式；hSOD1沉默已产生天花板效应；研究统计功效不足以检测小附加效应。临床意义方面，与需反复腰椎穿刺注射的tofersen相比，AAV递送miRNA可能一次给药持续表达；ASOs经RNase H介导mRNA降解并需重复给药，而AAV-miRNA可单次持久沉默。AMT-162的1/2期EPISOD1试验曾用AAVrh10衣壳单次鞘内递送抗SOD1 miRNA，因剂量限制性背根神经节毒性停止开发，提示载体特异生物分布和剂量优化仍关键。rAAV2-retro在肝和心转导很低，可能减少肝相关脱靶效应，但未直接评估肝毒性。限制包括：外周仅评估肝和心且使用C57BL/6J小鼠；发病定义为体重较峰值下降10%；未前瞻性设计等效性检验；未用纵向混合效应模型；未检测性别差异；多终点增加I型错误风险；未纳入WT同窝仔；SOD1^G93A模型不能代表散发性ALS异质性。研究结论翻译：单次鞘内剂量的rAAV2-retro-miRNA是SOD1^G93A小鼠模型中的有效基因沉默方法，在C57BL/6J小鼠中观察到肝和心外周转导有限。然而，这些数据也显示在测试条件下通过添加IGF1获得额外益处的困难。本研究确立的是，rAAV2-retro递送的miRNA沉默hSOD1在SOD1^G93A小鼠模型中有效，但在本文测试条件下未观察到IGF1的统计学可检测额外益处。