基于分子振动光谱与生物学解析神经血管单元共培养体系中的细胞间相互作用

《Cells》：Decoding Cell–Cell Interactions in Neurovascular Unit Co-Cultures Through Molecular Vibrational Spectroscopy and Biology

　　

摘要专业翻译 血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）是一个协调的多细胞界面，其中细胞间通讯塑造了对损伤和代谢应激的响应。然而，各细胞类型对集体应激适应的贡献仍知之甚少。本研究检测了由内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞组成的二维（2D）神经血管单元（neurovascular unit, NVU）共培养模型在暴露于缺氧或亚致死性HgCl2毒性后的分子和代谢反应。研究采用整合平台，结合基因与蛋白表达谱分析、无标记振动光谱成像及基于机器学习的分析，评估单培养和共培养配置中应激诱导的细胞周期调控和代谢变化。缺氧广泛抑制G1/S和G2/M调控因子，诱导细胞周期阻滞且细胞死亡有限，与适应性反应一致。HgCl2引起异质性、模型依赖性的活力和增殖能力变化。光谱表型分析显示，三重共培养呈现与周细胞单培养相似的 spectral 特征，尽管细胞间相互作用与培养条件差异的贡献无法区分。荧光成像进一步揭示了细胞间接触位点的线粒体相关信号，提示线粒体物质可能与紧密细胞相互作用区域相关。周细胞的存在与所研究的共培养配置中更具应激抵抗性的细胞表型相关。所建立的光谱-分子平台为表征多细胞NVU共培养模型中的细胞通讯和应激反应提供了无标记框架。

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一、研究背景与意义

血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）是保护中枢神经系统的重要生理界面，由脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells, BMECs）及其与周细胞、星形胶质细胞、神经元和小胶质细胞的相互作用共同构成，形成神经血管单元（neurovascular unit, NVU）。BBB功能障碍与多种神经系统疾病相关，包括卒中、癫痫、帕金森病和阿尔茨海默病。然而，细胞特异性和多细胞对损伤的响应机制仍不完全清楚。

传统研究依赖体内动物模型，但物种间血管表型和转运体表达的差异限制了向人类生物学转化的准确性。体外BBB模型如Transwell系统和微流控芯片虽能评估屏障功能，但存在无法模拟血流剪切力、限制细胞间直接物理接触、成本高昂等技术局限。2D和3D多细胞共培养模型能够更好地模拟NVU空间微环境并促进复杂的细胞间相互作用，但既往研究多聚焦于屏障完整性指标，对细胞间通讯和代谢应激响应的分子机制研究不足。

二、研究目的

本研究旨在建立平面直接接触的2D NVU共培养系统，在亚汇合条件下维持可空间分辨的细胞和亚细胞区域，整合靶向分子分析与无标记振动光谱成像，系统表征不同培养配置下细胞周期调控、代谢重塑及对缺氧和毒性应激的响应差异。

三、主要关键技术方法

研究人员采用多种核心技术：RT-qPCR和Western blot检测细胞周期调控因子的基因和蛋白表达；流式细胞术进行免疫表型分析和细胞周期分布检测；傅里叶变换红外光谱（FTIR）成像、共聚焦拉曼（Raman）光谱成像和光学光热红外光谱（O-PTIR）成像进行无标记分子化学成像；主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、支持向量机（SVM）、多元曲线分辨（MCR）和k-means聚类分析（KMCA）等机器学习方法处理光谱数据；MitoTracker荧光染色结合荧光显微镜观察线粒体分布。细胞系包括永生化人脑微血管内皮细胞（HBMEC）、人星形胶质细胞（HA）和人脑血管周细胞（HBVP）。

四、研究结果

3.1 细胞模型及其表型鉴定：通过流式细胞术和Western blot确认各细胞系标志物表达。FTIR光谱PCA分析显示三种细胞系具有独特光谱特征，PLS-DA和SVM分类模型准确率、特异性和敏感性达0.95–1.0。对三重共培养细胞的光谱分类显示，98%的共培养细胞被归类为HBVP样特征，表明三重共培养的总体光谱特征向周细胞参考类群显著趋同。拉曼MCR分析显示，HBMEC富含脂滴（占细胞面积13%），HBVP的细胞色素信号最强（占10%）。

3.2 缺氧和神经毒性对NVU共培养模型的影响：缺氧和20 μM HgCl₂处理24小时未导致细胞类型比例选择性改变，表明观察到的变化反映应激诱导的细胞生理改变而非细胞毒性。

3.3 细胞对应激的响应：缺氧显著降低HBMEC、HA及HBMEC+HA的细胞数量，而含周细胞培养组细胞数保持稳定。缺氧诱导HBMEC和HA的G₂期阻滞和HA的S期减少，提示细胞周期阻滞而非细胞死亡。HgCl₂仅在三重共培养中降低细胞总数。FTIR PCA显示HBMEC和HA对应激更敏感，HBVP相对抵抗，含周细胞的共培养呈现向HBVP样光谱特征的趋同。

3.4 基因和蛋白水平的应激响应：三重共培养呈现最受限且协调的分子响应，仅TP53和CDKN1B两个调控因子下调，符合受控的适应性暂停模式。较简单的单培养和双共培养显示更广泛的失调。缺氧在多种培养条件下抑制G₁/S和G₂/M调控因子。HgCl₂暴露后三重共培养中CDK1 Tyr15抑制性磷酸化增加，提示多细胞背景下G₂/M检查点调控改变。紧密连接相关基因TJP1、TJP3和CLDN1的表达在多组比较校正后无显著应激诱导变化。

3.5 非接触细胞间通讯的拉曼标记物与应激响应：HgCl₂在HBMEC和HA中诱导大量脂滴形成，而在HBVP中不明显。HgCl₂处理后的HBMEC和HA中检测到应激颗粒样结构。缺氧条件下，HBVP细胞特征对三重共培养的贡献通过富蛋白组分的出现体现，HBVP和HBMEC+HA+HBVP中细胞色素信号增加。

3.6 细胞间接触的光谱检测：拉曼成像显示细胞通过丝状伪足建立接触，KMCA图谱揭示接触区域富含不饱和脂肪酸和细胞色素的微小结构。O-PTIR成像显示甘油三酯沿细胞边缘积累。MitoTracker荧光染色在常氧和缺氧条件下均检测到细胞紧密接触区域的线粒体相关荧光信号。应激条件下细胞间接触区域的细胞色素信号、脂肪酸不饱和度、蛋白交联和核酸信号发生模型依赖性变化。

五、讨论总结

研究建立的平面亚汇合2D共培养模型不模拟连续内皮屏障，而是为研究NVU细胞间相互作用和分子应激响应提供平台。FTIR分析显示共培养导致显著的分子重塑，光谱特征向周细胞样表型趋同，但该结果应解释为光谱特征相似性而非细胞谱系转变。周细胞的存在与更强的应激抵抗表型相关，但研究设计不能确立因果关系。缺氧主要通过细胞周期阻滞而非细胞死亡发挥作用，三重共培养呈现更受限的分子响应模式。线粒体相关信号在细胞接触区域被检测到，但不能确立细胞间线粒体转移。研究存在培养条件差异和无法直接评估屏障紧密性等局限性。

六、研究结论

研究人员表征了包含内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞的双重及三重配置NVU体外模型，以研究持续缺氧和亚致死重金属神经毒性应激下的细胞和分子响应。不同培养配置与不同的细胞周期调控和代谢重塑模式相关。在所研究的应激条件下，三重共培养表现出相对有限的细胞周期相关改变。含周细胞的培养与缺氧条件下部分细胞参数的更好保持相关，但这些观察不能确立因果性保护机制。此外，单培养与共培养之间的差异不能完全归因于细胞间相互作用，因为培养基和基质条件也存在差异。将分子生物测定与FTIR、拉曼和O-PTIR化学成像相结合，为全细胞、亚细胞和细胞间接触水平的无标记生化异质性表征提供了互补方法。高光谱数据分析能够识别具有独特分子特征的细胞内区域，并揭示脂质、蛋白、细胞色素和核酸相关信号的改变，而定性荧光成像在细胞紧密相互作用区域识别到线粒体相关信号。这些观察不能确立细胞间线粒体转移。总体而言，靶向分子分析与空间分辨化学成像的整合为表征多细胞NVU模型中的细胞表型和应激相关分子变化提供了有价值的框架。